[發明專利]一種快速檢測嗜肺軍團菌的CPA引物組及其檢測方法

在審

• 申請號: 201710358715.8
• 申請日: 2017-05-19
• 公開（公告）號: CN107419006A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 陸勇軍;林韻;肖賢聲;吳若紅;肖曉臻;肖曉波;曾子芳;黃艷峰;張貴云
• 申請（專利權）人: 中山大學;廣州市金潤環?？萍加邢薰?/a>
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于微生物分子檢測技術領域。更具體地，涉及一種快速檢測嗜肺軍團菌的CPA引物組及其檢測方法。

背景技術

軍團菌屬細菌（Legionella sp.）是一類革蘭氏陰性菌，廣泛存在于天然淡水或人工水體中。該菌的許多種類一旦以氣溶膠的方式被易感人群吸入肺中，即有可能在肺泡中繁殖，并導致軍團?。↙egionellosis或Legionnaires’ disease, LD）。軍團病可分為龐蒂亞克熱（Pontiac fever）和軍團菌肺炎（Legionnaires pneumonia）。前者是一種自限性流感樣疾病，后者按嚴重程度從輕微咳嗽到快速致命的肺炎不等。嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila）是軍團病最主要的致病原。1976年，美國費城召開的退伍軍人大會上暴發了一場大規模感染，221人出現非典型肺炎癥狀，34人死亡；次年分離出致病菌株，即嗜肺軍團菌。此后，軍團菌病在世界各地時有暴發流行，我國也于1982年首次報道了軍團菌病的臨床病例。研究表明，軍團菌肺炎暴發的首要風險來自于中央空調冷卻塔和供水系統；衛生部也于2012年發布的《公共場所集中空調通風系統衛生規范》中明確指出，集中空調系統冷卻水和冷凝水中不得檢出嗜肺軍團菌。隨著我國城市化水平的提高，空調及供水系統普及，嗜肺軍團菌的檢測對預防軍團菌病的爆發和流行無疑具有重要意義。

自軍團菌病于1977被報道以來，環境中嗜肺軍團菌的檢測就獲得極大的重視，各種檢測方法也不斷出現。傳統的嗜肺軍團菌檢測方法有分離培養、血清抗體檢測、尿抗原檢測等。細菌培養法是檢測嗜肺軍團菌的“金標準”，但其生長所需營養豐富，耗時長，檢測成本高且效率低下；血清學檢測則存在滯后性，缺乏早期診斷意義；尿抗原檢測對血清型1型（LP1）以外的嗜肺軍團菌敏感性較低。而近年來發展起來的分子生物學技術以其快速、簡便、特異、敏感等優點，已在嗜肺軍團菌檢測及軍團病快速診斷方面占有一席之地。其中，聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）無疑是一種相對成熟、應用廣泛的方法。但是，PCR依賴于熱循環完成擴增，在實際應用中往往離不開昂貴的儀器熱循環儀（即PCR儀）。

交叉引物擴增法（Cross Priming Amplification, CPA）是由杭州優思達生物技術有限公司發明的DNA恒溫擴增技術（專利號200810134583.1）。CPA利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）及多條引物，在65℃恒溫條件下可實現目標區域高效、快速的擴增。該方法的重點和難點在于引物組的設計，即各引物的位點選擇與引物序列確定。目前，尚未有將CPA應用于嗜肺軍團菌檢測的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中嗜肺軍團菌檢測技術的缺陷和不足，建立了一種嗜肺軍團菌的CPA檢測方法，其檢測靶標為嗜肺軍團菌IVB型分泌系統（Type IVB secretion system, T4BSS）的結構基因dotA。所述方法簡便、快速、高效，特異性強，靈敏度高，對儀器要求低，且擴增靈敏度高于普通PCR，具有較大的應用前景。

本發明的目的是提供一種快速檢測嗜肺軍團菌的CPA引物組。

本發明另一目的是提供一種快速檢測嗜肺軍團菌的方法。

本發明的再一目的是提供一種快速檢測嗜肺軍團菌的試劑盒。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一種檢測嗜肺軍團菌的CPA引物組，所述引物組包含一條交叉引物CP，一對剝離引物DPF/DPR和一對檢測引物DF/DR，其序列依次如SEQ ID NO：1～5所示。

目前的研究表明，dotA基因對嗜肺軍團菌至關重要，缺失dotA的嗜肺軍團菌將完全喪失毒力和感染能力。因此本發明通過比對嗜肺軍團菌IVB型分泌系統（Type IVB secretion system, T4BSS），以結構基因dotA為靶標設計篩選了CPA檢測引物組，所述引物組包含一條交叉引物CP，一對剝離引物DPF/DPR和一對檢測引物DF/DR。所述寡聚核苷酸鏈能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使DNA的循環擴增能不斷的實現。

同時，所述CPA引物組在檢測和/或鑒定嗜肺軍團菌中的應用，以及在制備嗜肺軍團菌檢測試劑或試劑盒中的應用。亦在本發明保護范圍內。

一種快速檢測嗜肺軍團菌的方法，包括如下步驟：