[發(fā)明專利]一種通過(guò)生物技術(shù)擴(kuò)增脫氧胸苷三磷酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710358519.0
• 申請(qǐng)日: 2017-05-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107164363A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳華成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 太倉(cāng)新亞遜生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，尤其涉及一種通過(guò)生物技術(shù)擴(kuò)增脫氧胸苷三磷酸的方法。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美國(guó)Centus公司的Kary Mullis發(fā)明，于1985年由Saiki等在Science雜志上首次報(bào)道，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)。通過(guò)PCR可以簡(jiǎn)便、快速地從微量生物材料中以體外擴(kuò)增的方式獲得大量特定的核酸，并且有很高的靈敏度和特異性，可在動(dòng)物檢疫中用于微量樣品的檢測(cè)。

DNA分子是由四種脫氧核糖核苷酸分子結(jié)合成的兩條互補(bǔ)多聚核苷酸鏈。合成這些多聚核苷酸的前體是四種脫氧核苷三磷酸，脫氧胸苷三磷酸作為四種原料之一參與核酸分子的體內(nèi)或體外擴(kuò)增。附著生物技術(shù)工業(yè)的發(fā)展特別是DNA生物合成和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的推廣，市場(chǎng)上對(duì)DNA擴(kuò)增所需要的脫氧核苷三磷酸的需求量將會(huì)明顯地持續(xù)升高。另外，由于脫氧胸苷三磷酸在抗病毒抗腫瘤，治療心血管疾病等方面應(yīng)用的推廣，同樣也會(huì)對(duì)本發(fā)明所闡述的產(chǎn)品，脫氧胸苷三磷酸的需求量的提高起到促進(jìn)作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種一種通過(guò)生物技術(shù)擴(kuò)增脫氧胸苷三磷酸的方法，采用的技術(shù)方案是：

一種通過(guò)生物技術(shù)擴(kuò)增脫氧胸苷三磷酸的方法，其包括：脫氧胸苷三磷酸模版DNA、限制性切刻酶、DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸、與靶核酸序列3’末端互補(bǔ)的寡核苷酸引物、表面活性劑，所述方法包括以下步驟：

a、在樣品脫氧胸苷三磷酸模版DNA培養(yǎng)液中加入一種或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性切刻酶，該限制性切刻酶在該DNA的一條鏈上形成特定的3’末端；

b、加入寡核苷酸引物，該啟動(dòng)子引物5’區(qū)域包含被DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列，且其3’區(qū)域與步驟a形成的DNA特定的3’末端互補(bǔ)；

c、向樣品中加入DNA聚合酶，脫氧核苷三磷酸，表面活性劑；

d、控制溫度，將如此形成的混合物保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。

至少兩種與靶核酸序列3’末端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶。

至少一種脫氧核苷三磷酸。

所述表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨醇單脂肪酸脂。

所述培養(yǎng)液的溫度控制在40℃～50℃內(nèi)。

所述溶液在基本恒溫的條件下進(jìn)行擴(kuò)增的時(shí)間為45～60分鐘。

所述溶液的PH值控件在7.0－8.0。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明基本上在恒溫的條件下擴(kuò)增靶核酸序列，以外通過(guò)添加限制性切刻酶而不需要額外添加任何另外的試劑，而且時(shí)間短，工藝結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，降低了生產(chǎn)成本。

具體實(shí)施方式

一種通過(guò)生物技術(shù)擴(kuò)增脫氧胸苷三磷酸的方法，其包括：脫氧胸苷三磷酸模版DNA、限制性切刻酶、至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶、至少一種具有鏈置換能力的DNA聚合酶、至少兩種與靶核酸序列3’末端互補(bǔ)的寡核苷酸引物、聚氧乙烯失水山梨醇單脂肪酸脂表面活性劑，所述方法包括以下步驟：a、在樣品脫氧胸苷三磷酸模版DNA培養(yǎng)液中加入一種或多種能夠在所選限制位點(diǎn)切割DNA的限制性切刻酶，該限制性切刻酶在該DNA的一條鏈上形成特定的3’末端；b、加入寡核苷酸引物，該啟動(dòng)子引物5’區(qū)域包含被DNA的RNA聚合酶所識(shí)別的啟動(dòng)子序列，且其3’區(qū)域與步驟a形成的DNA特定的3’末端互補(bǔ)；c、向樣品中加入DNA聚合酶，脫氧核苷三磷酸，表面活性劑；d、控制溫度，將如此形成的混合物保持足夠的時(shí)間，以進(jìn)行擴(kuò)增。所述培養(yǎng)液的溫度控制在40℃～50℃內(nèi)，所述溶液在基本恒溫的條件下進(jìn)行擴(kuò)增的時(shí)間為45～60分鐘，所述溶液的PH值控件在7.0－8.0。