[發明專利]一種用于敲除CHO細胞中FUT8和DHFR兩種基因的試劑盒

有效

• 申請號: 201710357070.6
• 申請日: 2017-05-19
• 公開（公告）號: CN107034234B
• 公開（公告）日: 2018-04-10
• 發明（設計）人: 羅世超;羅川
• 申請（專利權）人: 四川豐訊科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙)51222
• 代理人: 張娟,劉華玲

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種用于敲除CHO細胞中FUT8基因和DHFR基因的試劑盒。

背景技術

中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO細胞)是目前生產藥物蛋白最常用的宿主細胞，被廣泛應用于抗體、重組蛋白藥物和疫苗等產品的研發和生產。抗體藥物是當前最主要的生物技術類藥物，如何進一步提高CHO細胞抗體藥物的效能和產量，是目前研究的熱點。

α-1,6巖藻糖基轉移酶(α-1,6fucosyltrasnferase,FUT8)是巖藻糖基轉移酶基因超家族的一員，FUT8催化的核心巖藻糖基化是糖蛋白重要的翻譯后修飾和功能調控方式。利用宿主細胞表達抗體藥物時，抗體的糖基化修飾影響其在體內的功能和穩定性。研究表明，與巖藻糖基化的抗體相比，去除或降低巖藻糖基化的抗體會表現出更強的ADCC效應(抗體依賴性細胞毒性)，抗體性能佳。因此，敲除工程細胞株的FUT8，使表達的抗體無巖藻糖基化修飾，是提高抗體性能的有效手段。

二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一種催化5，6-二氫葉酸還原為5，6，7，8-四氫葉酸的蛋白酶，參與細胞內的嘌呤代謝過程。當細胞株缺失了DHFR基因，將攜帶DHFR基因的表達載體轉染細胞，陽性細胞也就獲得了DHFR基因，此時在培養基中加入甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)，會導致DHFR基因擴增，連帶其兩側片段也得到相應擴增，可使目的基因的拷貝數增加幾百到幾千倍，從而達到目的基因的高效表達。因此，急需要敲除CHO細胞株的DHFR基因，以提高外源基因蛋白表達量。

Crispr/Cas9系統，是細菌和古細菌在進化過程中演變出來的一種用于抵御外來侵害的免疫入侵系統，在現代基因工程應用領域與TALEN(transcription activator-like effector nuclease)以及ZFN(zinc-finger nuclease)技術并列成為三大基因組編輯工具。CRISPR-Cas9技術具有特異性DNA識別能力，Cas9核酸內切酶在向導核糖核酸(guide RNA，sgRNA)引導下切割雙鏈DNA，造成基因組雙鏈斷裂，利用細胞基因組修復的不穩定性產生非特異重組來產生修復錯誤(插入或者缺失)，從而可能產生移碼突變而造成基因功能的喪失，實現基因敲除的目的。相比較于TALEN及ZFN技術，其sgRNA的設計和合成工作量遠遠小于TALEN和ZFN識別模塊的構建過程，易于操作，而且效率更高、更容易得到純合子突變體。

目前研究中，未見通過CRISPR-Cas9系統，敲除CHO細胞中FUT8和DHFR兩種基因的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于敲除CHO細胞中FUT8基因和DHFR基因的的試劑盒及其用途。

FUT8基因：為α-(1,6)-巖藻糖基轉移酶基因；

DHFR基因：為二氫葉酸還原酶基因。

本發明提供了一種用于敲除CHO細胞中FUT8基因和DHFR基因的試劑盒，它包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3所述的sgRNA序列，以及SEQ ID NO：23所述的sgRNA序列。

本發明還提供了一種用于敲除CHO細胞中FUT8基因和DHFR基因的試劑盒，它包括SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：31所述的sgRNA序列

本發明還提供了上述試劑盒在用于敲除CHO細胞中FUT8和DHFR兩種基因的用途。

本發明還提供了上述試劑盒在制備FUT8和DHFR基因同時缺失的細胞株中的用途。

本發明還提供了一種同時敲除CHO細胞中FUT8和DHFR基因的方法，它是利用CRISPR/Cas9系統在CHO細胞中對兩種基因進行改造，步驟如下：

a、合成SEQ ID NO：1和/或3所述的序列及其互補鏈，變性、退火，形成雙鏈，插入到Cas9表達載體的多克隆位點，得到重組表達質粒；

b、將步驟a的重組表達載體轉染CHO細胞，挑取單個細胞，接種培養；

c、待單個細胞增殖為單克隆后，鑒定并確認FUT8基因被敲除，并獲得FUT8基因缺失的細胞株FUT8-/-，備用；

d、合成SEQ ID NO：23所述的序列及其互補鏈，變性、退火，形成雙鏈，插入到Cas9表達載體的多克隆位點，得到重組表達質粒；

e、取步驟c的FUT8-/-細胞株，用步驟d的重組表達載體轉染，挑取單個細胞，接種培養；