[發明專利]一種肝癌早期檢測試劑盒的制備方法

在審

• 申請號: 201710355802.8
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN107271661A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 焦緒棟;李文軍;秦松
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙)44316
• 代理人: 趙勍毅

技術領域

本發明涉及肝癌檢測技術領域，尤其涉及一種肝癌早期檢測試劑盒的制備方法。

背景技術

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，位居腫瘤死亡的第二位，我國每年約有13萬人死于肝癌，占全球新發肝癌人數的一半以上。大多數肝癌患者就診時已屆中、晚期，錯失最佳治療時機，早期診斷和早期治療是防治肝瘤和降低死亡率的最有效辦法。目前肝癌的早期診斷主要依靠影像學檢查與腫瘤標志物的測定，腫瘤標志物的測定具有敏感性、特異性高，痛苦少等優點越來越受到重視。

腫瘤標志物的檢測主要是通過免疫學的方法。在免疫學分析與檢測中，由于生物大分子結構比較復雜，直接檢測較困難，所以通常在免疫檢測體系中引入熒光探針技術，即用熒光素等小分子標記生物大分子，利用適當的儀器檢測熒光標記物的信號，達到檢測的目的。傳統的熒光探針包括異硫氰酸熒光素(FITC)、熒光素、羅丹明(Rodam)等。很多生物樣品(如血清)其本身熒光位于400～600nm，而傳統熒光探針的熒光發射波長處于可見光區，二者重疊區域較大，造成自然本底熒光干擾，影響檢測的敏感性，而且傳統熒光探針存在非特異性吸附，嚴重阻礙免疫熒光技術的發展。且傳統的藻膽蛋白熒光探針的制備多采用化學交聯技術。化學交聯是指在熱、光、高能輻射、超聲波、機械力、交聯劑等作用下，利用化學鍵將大分子鏈連結起來，形成體形或網狀結構高分子的過程。如果采用化學交聯技術將藻膽蛋白和酶標記，則反應后酶的活性可能會降低，而且化學交聯的前期準備工作較復雜，需要單獨純化各種交聯原材料，交聯副產物較多。

發明內容

鑒于此，有必要提供一種靈敏度高、副產物少的的肝癌早期檢測試劑盒的制備方法。

一種肝癌早期檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

將肝癌表面抗原用PBST溶液配制成濃度為0.1-100ng/mL的肝癌表面抗原溶液，置于4-6℃備用；

將抗所述肝癌表面抗原的單克隆抗體用PBST溶液配制成濃度為5-10μg/mL抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液，置于4-6℃備用；

將熒光酶標板用所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液在4-6℃包被16-20小時，棄去溶液；

將所述熒光酶標板用PBST溶液沖洗；

將所述熒光酶標板采用含有質量分數為5％的脫脂牛奶或小牛血清白蛋白的PBST溶液在4-6℃進行非結合位點的封閉；

將所述熒光酶標板用PBST溶液沖洗；

在所述熒光酶標板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小時；

將所述熒光酶標板用PBST溶液沖洗；

在所述熒光酶標板中，每孔中加入生物素化的抗肝癌表面抗原的單克隆抗體的PBST溶液，于20-24℃孵育1-2小時；

將所述熒光酶標板用PBST溶液沖洗；

在所述熒光酶標板中，每孔加入重組藻藍蛋白亞基的PBST溶液，于20-24℃孵育1-2小時；

將所述熒光酶標板用PBST溶液沖洗，得到所述肝癌早期檢測試劑盒。

在其中一個實施例中，所述PBST溶液包含有20mM KH₂PO₄、100mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.37M NaCl、27mMKCl和質量分數為0.05％的吐溫20，pH為7.4。

在其中一個實施例中，所述肝癌表面抗原為AFP或CEA。

在其中一個實施例中，所述熒光酶標板為96孔板或48孔板。

在其中一個實施例中，所述重組藻藍蛋白亞基包括藻膽蛋白蛋白亞基、色基、麥芽糖結合蛋白、鏈霉親和素核心蛋白。

在其中一個實施例中，將熒光酶標板用所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液在4-6℃包被16-20小時，棄去溶液的步驟中，所述抗肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液的用量為200-250μL。

在其中一個實施例中，在所述熒光酶標板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小時的步驟中，所述肝癌表面抗原溶液的用量為100μL。

在其中一個實施例中，所述生物素化的抗所述肝癌表面抗原的單克隆抗體溶液的終濃度為5-10μg/mL，用量為100μL。

在其中一個實施例中，所述重組藻藍蛋白亞基的PBST溶液的終濃度為30-50μg/mL，用量為100μL。