[發(fā)明專利]一種內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710353716.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-18
• 公開（公告）號(hào): CN107034233B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 裴得勝;羅娟娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/65;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 周建軍

1.一種內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟A：選擇內(nèi)源性基因，所述內(nèi)源性基因?yàn)榘唏R魚膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP，在內(nèi)源性基因的3’UTR區(qū)域選擇打靶位點(diǎn)以及打靶序列，將打靶序列反轉(zhuǎn)錄為gRNA，構(gòu)建打靶序列的gRNA序列的方法為：以帶有g(shù)RNA骨架的質(zhì)粒為模板，以正向引物gRNA-F和反向引物序gRNA-R為引物擴(kuò)增gRNA的DNA序列；將所述gRNA與Cas9 capped RNA共同注射入動(dòng)物受精卵中，培育受精卵，檢測獲得突變序列，篩選得到打靶位點(diǎn)，備用；所述打靶序列如SEQ ID NO.1所示，所述打靶序列的正向引物gRNA-F序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物gRNA-R序列如SEQID NO.3所示，所述打靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.19所示；

步驟B：構(gòu)建外源性基因重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包括打靶位點(diǎn)、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位點(diǎn)與外源基因之間的3’UTR區(qū)、密碼子置換后的打靶位點(diǎn)、后同源臂；所述前同源臂序列如SEQ ID NO.20所示，所述融合蛋白T2A序列如SEQ ID NO.21所示，所述外源基因序列如SEQ ID NO.22所示，所述打靶位點(diǎn)與外源基因之間的3’UTR區(qū)序列如SEQ ID NO.23所示，所述密碼子置換后的打靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.24所示，所述后同源臂序列如SEQ ID NO.25所示；所述重組表達(dá)載體序列如SEQ ID NO.12所示；

步驟C：將Cas9 capped RNA、步驟A獲得的gRNA、步驟B獲得的重組表達(dá)載體共同注射入斑馬魚的受精卵中，使得目的基因整合進(jìn)入基因組，選育得到內(nèi)源性GFAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源性基因表達(dá)特定熒光的斑馬魚。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟C中，將Cas9 capped RNA、步驟A獲得的gRNA、步驟B獲得的重組表達(dá)載體共同注射入動(dòng)物的受精卵后，培育得到由內(nèi)源性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源性插入熒光蛋白表達(dá)的嵌合體F₀代，將嵌合體F₀代與野生型動(dòng)物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體F₁代，將F₁代發(fā)熒光的個(gè)體與野生型動(dòng)物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體F₂代，將F₂代雌性個(gè)體與雄性個(gè)體自交，篩選得到發(fā)熒光的純合體F₃代。

3.一種外源性基因重組表達(dá)載體，其特征在于：包括打靶位點(diǎn)、前同源臂、融合蛋白T2A、外源基因、打靶位點(diǎn)與外源基因之間的3’UTR區(qū)、密碼子置換后的打靶位點(diǎn)、后同源臂；

所述打靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.19所示，所述前同源臂序列如SEQ ID NO.20所示，所述融合蛋白T2A序列如SEQ ID NO.21所示，所述外源基因序列如SEQ ID NO.22所示，所述打靶位點(diǎn)與外源基因之間的3’UTR區(qū)序列如SEQ ID NO.23所示，所述密碼子置換后的打靶位點(diǎn)序列如SEQ ID NO.24所示，所述后同源臂序列如SEQ ID NO.25所示；所述重組表達(dá)載體序列如SEQ ID NO.12所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的外源性基因重組表達(dá)載體在培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體中的用途。