[發明專利]無碳源阻遏畢赤酵母表達系統、其建立方法及應用

有效

• 申請號: 201710352843.1
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN108949869B
• 公開（公告）日: 2022-12-02
• 發明（設計）人: 蔡孟浩;劉啟;周祥山;張元興
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N1/19;C12N15/62;C12R1/84;C12R1/78;C12R1/72;C12R1/645
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種高表達量的、無碳源阻遏的、增強型甲醇營養型酵母表達系統，其建立方法及應用。本發明揭示了一種消除甲醇誘導型啟動子單一甲醇碳源依賴性和碳源嚴重阻遏的方法，通過人工改造甲醇營養型酵母細胞內的轉錄調控遺傳線路，提高啟動子轉錄強度并改變其調控模式。本發明的酵母表達系統以及表達方法，使得原本依賴甲醇誘導、存在碳源阻遏的啟動子不再依賴甲醇，在其它碳源條件下也可高效地表達外源多肽，最高表達量可達野生型AOX1啟動子甲醇條件下的5倍。

技術領域

本發明屬于生物工程領域；更具體的，本發明涉及一種無碳源阻遏畢赤酵母表達系統、其建立方法及應用。

背景技術

近年來，生物制品在人們生產生活中所占的比重越來越高，而大部分生物制品如：疫苗、抗體、抗菌肽、抗生素等幾乎都是通過異源表達的方式進行生產。而在采用模式生物異源表達生物制品的過程中，由啟動子引導的轉錄起始過程是蛋白表達的關鍵步驟。因此強力可調控的啟動子一直是高水平表達外源蛋白所必不可少的工具。

畢赤酵母中的醇氧化酶(Aox1)啟動子(P_AOX1)是目前最強力的啟動子，已用于表達多種外源蛋白，胞內表達量和胞外表達量最高分別可達到22g/L的和15g/L。因此，P_AOX1常被用來進行改造以獲得具有更高啟動強度、不依賴甲醇誘導的合成型啟動子。目前對于P_AOX1的改造主要針對于其啟動子序列的缺失或者插入及轉錄調控因子表達水平的調控。在這些研究中在甲醇誘導下相對野生型活性最好的的突變啟動子分別為Hartner等的160％、Xuan等的157％。但是由于P_AOX1的調控網絡尚未完全清晰，在大規模應用中還存在諸多問題。近年來已經商業化的不依賴甲醇的啟動子只有奧地利VTU Technology公司，他們通過對P_AOX1序列進行的改造開發的2nd P_AOX1在甘油誘導下能夠達到1nd P_AOX1(野生型菌株的P_AOX1)在甲醇誘導下的18.2％～114.3％，并且要高于P_GAP的表達水平，已經達到工業應用的水平。盡管非甲醇誘導P_AOX1的研究已經取得了很大的突破，但是仍舊無法改變P_AOX1調控模式單一，碳源嚴重阻遏等問題。

因此，如果得到一種調控更加靈活、能夠利用非甲醇誘導啟動子表達的方法，使原本依賴甲醇誘導的啟動子在其它碳源作為單一碳源的條件下也能夠更為高效的轉錄，這對于實現工業上利用畢赤酵母靈活、高效的表達外源多肽具有積極意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過人工改造甲醇誘導/碳源阻遏型啟動子轉錄調控遺傳線路從而構建更為強力的新型表達系統的方法。

在本發明的第一方面，提供一種無碳源阻遏性表達外源多肽的方法，包括：

(1)提供甲醇營養型酵母，所述甲醇營養型酵母含有：

表達盒1，其表達外源的DNA結合蛋白和轉錄激活因子的融合多肽，以及

表達盒2，從5’→3’依次包括操作性連接的：蛋白結合序列、甲醇誘導型啟動子，外源多肽編碼基因；

(2)在無甲醇條件或非單一甲醇碳源條件下、培養(1)的甲醇營養型酵母，表達外源多肽。

在一個優選例中，所述的甲醇營養型酵母包括：畢赤酵母(Pichia)，漢遜酵母(Hansenula)，假絲酵母(Candida)，球擬酵母(Torulopsis)；較佳地，所述的甲醇營養型酵母是畢赤酵母。

在另一優選例中，所述的畢赤酵母是：GS115畢赤酵母菌株。

在另一優選例中，所述的表達盒1中，包括啟動子以及與之操作性連接的DNA結合蛋白和轉錄激活因子的融合多肽的編碼基因。