[發(fā)明專利]無血清培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710351851.4
• 申請(qǐng)日: 2017-05-18
• 公開（公告）號(hào): CN107287157A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 竺王玉;何松彬;方可欣;陳冬冬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 舟山醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙)33228
• 代理人: 王樹鏞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及無血清培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

2009年Zhang等從人牙齦組織中分離培養(yǎng)出一種新牙齦來源的間充質(zhì)干細(xì)胞之后，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特性，并且生長(zhǎng)迅速、均一、無致瘤性，經(jīng)多次傳代后仍保持有間充質(zhì)干細(xì)胞的表型及端粒酶活性，優(yōu)于骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞。GMSCs不僅在再生醫(yī)學(xué)發(fā)揮作用，而且已成為細(xì)胞免疫治療的種子細(xì)胞，然而，目前用于GMSCs培養(yǎng)基多為胎牛血清作為營(yíng)養(yǎng)來源，若將其應(yīng)用于人體，存在較大風(fēng)險(xiǎn)，如阮病毒感染，人體內(nèi)抗牛血清蛋白的產(chǎn)生等，因此，迫切需要應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)齒齦間充質(zhì)干細(xì)胞，并保持干細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)功能，最小化疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

新型內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供無血清培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

本發(fā)明要解決的問題是目前用于GMSCs培養(yǎng)基多為胎牛血清作為營(yíng)養(yǎng)來源，若將其應(yīng)用于人體，存在較大風(fēng)險(xiǎn)的問題。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

無血清培養(yǎng)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征有以下步驟：

a.進(jìn)行牙齦組織樣本取樣，樣本為牙齦切除術(shù)的牙齦健康的患者，年齡20~62歲，對(duì)患者口腔進(jìn)行局部麻醉，清洗口腔，用碘伏全面消毒后，做出切口標(biāo)記線，角形切口，按標(biāo)記線切開后，切除牙齦，將其置入10mL無菌1640 RPMI 培養(yǎng)液中，進(jìn)行充分的搖晃后靜止，送于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)；

b.準(zhǔn)備好材料：MesenGro無血清培養(yǎng)基、MEM-α培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、谷氨酰胺、胰蛋白酶、胎牛血清、鼠抗人CD3抗體，絲裂霉素C、地塞米松、吲哚美辛、IBMX、胰島素、抗壞血酸Vit C和β-甘油磷酸鈉。

獲取健康成人的健康牙齦組織，用RPMI 1640沖洗干凈，利用終濃度2 mg/mL 的dispaseⅡ消化8~12h后，加終濃度4 mg/mL 的collagenase Ⅳ在37℃溫度下消化2 h，獲取單個(gè)核細(xì)胞，10%濃度的 FBS MEM-α培養(yǎng)基培養(yǎng)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%融合后，用0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA 37℃消化2 min，傳代培養(yǎng)逐漸轉(zhuǎn)移至MesenGro無血清完全培養(yǎng)基中，臺(tái)盼藍(lán)未染色細(xì)胞存活率＞95%；

d.利用FACSCalibur流式細(xì)胞儀鑒定牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞表型，包括HLA-DR、CD29、CD33、CD34、CD73、CD105、CD90、CD86，在生長(zhǎng)良好的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞中加入標(biāo)準(zhǔn)的含有含地塞米松0.5 umol/L、吲哚美辛100 mmol/L、IBMX 0.5 mmol/L、胰島素10 mg/L、10% FBS MEM-α培養(yǎng)基成分的成脂誘導(dǎo)劑，在第21天進(jìn)行油紅O染色，相差顯微鏡下觀察脂肪小滴形成情況；加入含有含抗壞血酸Vit C50 ug/mL，地塞米松107 mol/L，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、10% FBS MEM-α培養(yǎng)基的礦化誘導(dǎo)液，第21天用0.1 %茜紅染色，相差顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。

先用紫外光照射96孔酶標(biāo)板，對(duì)96孔酶標(biāo)板進(jìn)行殺菌處理，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的10% FBS MEM-α、 MesenGro無血清培養(yǎng)的GMSCs以10³ cells/孔接種于96孔板內(nèi)，每孔0.1 mL，24 h、48 h、72 h、96 h、108 h后，每孔加入10 μL CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；

f.將第3代10%FBS MEM-α、MesenGro無血清培養(yǎng)GMSCs接種于96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)，第2日取新鮮外周血10 mL，利用密度1.077±0.001 g/mL的淋巴細(xì)胞分離液，分離獲得單個(gè)核細(xì)胞2×10⁷，將細(xì)胞重懸于10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，將貼壁的GMSCs與PBMC按梯度比例共培養(yǎng)，梯度比例分別為GMSCs：PBMC為1:1、 1:5、1:25、 1:50、1:100、1:200，經(jīng)過mitomycin處理的APC細(xì)胞和人CD3抗體刺激3 d后，將懸浮的PBMC轉(zhuǎn)移至新的96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞懸液加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值確定增殖后的PBMC量，并計(jì)算GMSCs對(duì)PBMC增殖的抑制率，抑制率=[（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/對(duì)照組]×100%。