[發明專利]一種測定氯霉素的免疫熒光檢測卡及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201710351732.9
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN107247140A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 鐘松清;譚攀;孫晶瑋;王軍亮
• 申請（專利權）人: 深圳市三方圓生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/533;G01N33/58
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 唐致明

1.一種測定氯霉素的免疫熒光檢測卡，包括墊板，其特征在于，還包括附于所述墊板上且依次緊密相連的樣品墊、耦聯物墊、反應膜和吸水墊，所述耦聯物墊上熒光微球標記的氯霉素抗體，所述反應膜上設有檢測線和質控線，所述檢測線靠近所述耦聯物墊，所述質控線靠近所述吸水墊，所述檢測線上包被有氯霉素抗原，所述質控線上包被有識別氯霉素抗體的二抗。

2.根據權利要求1所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡，其特征在于，所述免疫熒光檢測卡還包括上外殼和下外殼，所述上外殼蓋于所述樣品墊、所述耦聯物墊、所述反應膜和所述吸水墊上方，所述下外殼設于所述墊板的下方，所述上外殼和所述下外殼相互蓋合，所述上外殼在對應所述樣品墊的位置開設有加樣孔，所述上外殼在對應所述反應膜的位置設有觀察窗。

3.一種如權利要求1或2所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

制備樣品墊；

制備耦聯物墊：裁剪耦聯物墊膜，取熒光微球標記的氯霉素抗體噴涂在所述膜上，干燥；

制備反應膜：取反應膜，在所述反應膜上噴涂氯霉素抗原溶液，形成檢測線，在所述反應膜上噴涂識別氯霉素抗體的二抗溶液，形成質控線；

組裝檢測卡：取吸水墊和墊板，在所述墊板上依次搭接粘貼所述樣品墊、所述耦聯物墊、所述反應膜和所述吸水墊。

4.根據權利要求3所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，所述熒光微球標記的氯霉素抗體的制備方法包括以下步驟：

(1)熒光微球活化：將待活化的熒光微球加入緩沖液中，洗滌，固液分離，棄去上清液，收集固體物質復溶于緩沖液中，向所述緩沖液中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，振蕩反應，固液分離，收集固體物質并溶解于PB緩沖液中，得到熒光微球溶液；

(2)抗體標記：取氯霉素抗體溶于PBS緩沖液中，并將其加入所述熒光微球溶液中，振蕩反應一段時間，加入乙醇胺振蕩反應一段時間，再加入牛血清白蛋白溶液，封閉反應一段時間，固液分離，收集固體物質用PB緩沖液重新懸浮，得到熒光微球標記的氯霉素抗體。

5.根據權利要求4所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，所述氯霉素抗體是以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物為抗原獲得。

6.根據權利要求5所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，所述氯霉素半抗原的制備包括以下步驟：稱取氯霉素、琥珀酸酐，加入丙酮、吡啶，加熱回流，薄層層析檢測確認產物，去除丙酮，加水，調節pH至8-10，采用乙酸乙酯萃取，去除乙酸乙酯層，水相調節pH至酸性，采用異丁醇萃取，洗滌有機相，干燥，濃縮，得到氯霉素半抗原。

7.根據權利要求5所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。

8.根據權利要求4-7任一項所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡的制備方法，其特征在于，所述氯霉素抗體的制備包括以下步驟：以氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯物為抗原，用所述抗原免疫小鼠，將免疫鼠的脾臟細胞與鼠源骨髓瘤細胞融合，篩選，得到分泌氯霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，通過制備腹水得到氯霉素抗體。

9.一種采用權利要求1或2所述的測定氯霉素的免疫熒光檢測卡進行氯霉素檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將待測定樣品加到所述樣品墊上，進行免疫反應；

(2)將測定氯霉素的免疫熒光檢測卡置于熒光讀卡儀上，對熒光信號的強度進行讀取；

(3)結果的判斷：當所述檢測線和所述質控線在345nm激發光照射下同時顯示橙色熒光，且所述檢測線較所述質控線深或兩者顏色相同或相近，即表示檢測結果為陰性，說明檢測物中不含有氯霉素或所含氯霉素濃度小于0.05ng/mL；當所述檢測線和所述質控線在345nm激發光照射下，所述質控線顯示橙色熒光，而所述檢測線不顯熒光或較所述質控線顯色淺，即表示檢測結果為陽性，說明檢測物中含有氯霉素且濃度大于0.05ng/mL。