[發明專利]一種提高北柴胡毛狀根誘導效率及遺傳轉化效率的方法及其應用

有效

• 申請號: 201710351219.X
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN107119070B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 隋春;吳素瑞;魏建和;金鉞
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/06;A01H6/06
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發明提供了一種提高北柴胡毛狀根誘導效率及遺傳轉化效率的方法及其應用。本發明基于對發根農桿菌菌株、侵染菌液OD值、共培養時間等條件的摸索，確認了提高發根農桿菌的侵染效率的最佳組合條件，相比傳統的10％左右毛狀根誘導率，本發明提供的技術方案獲得的毛狀根誘導率達70％?85％。本發明提供了的提高北柴胡毛狀根遺傳轉化效率的方法，可以獲得80％以上的外源基因轉化率，為北柴胡功能基因研究和/或北柴胡毛狀根代謝產物的產業化提供了更好、更高效、更簡便的選擇。

技術領域

本發明生物技術領域，具體涉及一種提高北柴胡毛狀根誘導效率及遺傳轉化效率的方法及其應用。

背景技術

毛狀根，又稱發狀根，發根，是由發根農桿菌含有的Ri質粒上的T-DNA插入到植株或器官、組織(包括愈傷組織)、單個細胞、原生質體的細胞核基因組，而在感染部位產生的大量副產物。毛狀根的誘導培養可作為生物反應器，生產有應用價值的植物代謝產物。另外，還可通過發根農桿菌將外源基因導入，以調控目標代謝產物的合成。

柴胡是我國典型的傳統大宗藥材，有2 000多年的應用歷史。是疏散退熱、舒肝、升陽之要藥。北柴胡(Bupleurum chinense DC.)是我國國家藥典規定的柴胡基源植物之一，為傘形科柴胡屬多年生草本植物。我國東北、華北、西北、華東、湖北、四川等地均有分布和種植，是柴胡藥材的主要來源。

目前已有多種植物包括藥用植物具有毛狀根誘導培養體系，但每種植物的誘導培養體系都存在差異，在一種植物上有效的方法，換一種植物往往難以成功。在摸索特定植物毛狀根誘導培養體系過程中，通常是從發根農桿菌菌種的類別、植物外殖體類型、侵染方式、侵染時間等條件出發,通過試驗獲得最佳條件。

在《北柴胡毛狀根誘導及其植株再生體系的建立》(孫晶等，藥學學報，2013)一文中，我們研究了從設計多種誘導條件出發，探索建立穩定的柴胡毛狀根誘導體系。發根農桿菌A4 侵染北柴胡無菌苗葉基部，共培養3天后，轉入抑菌培養，10天開始出現毛狀根，經4～5 周培養，轉為液體搖培，獲得大量毛狀根，誘導產生的毛狀根可再生成植株。毛狀根再生成植株有兩種方式:一種是液體搖培的毛狀根自發脫落形成幼苗的繼續培養，另一種是將毛狀根產生脫落的類愈傷組織置于經篩選的再生固體培養基上再生成植株。柴胡毛狀根及其植株再生體系的建立，為開展柴胡次生代謝研究，尤其是利用農桿菌介導的遺傳轉化研究和利用奠定了基礎。然而，此體系用于多基因轉化毛狀根的研究及應用，效率比較低，毛狀根誘導率僅在10％左右。

在《農桿菌誘導北柴胡毛狀根體系建立及UGT基因功能初步研究》(孫晶等，微生物學，2014)一文中，參考前文提供的誘導方法，通過設計多種誘導條件，包括不同菌種種類、外植體類型、侵染方式和侵染時間等，探索建立穩定的北柴胡毛狀根誘導體系。發現：在采用發根農桿菌A4侵染北柴胡無菌苗葉基部，菌液浸染20min，置于固體培養基(B₅+乙酰丁香酮200μtmol/L+蔗糖20g/L或MS+NAA 6mg/L+乙酰丁香酮200mol/L+蔗糖20g/ L)共培養3d后，轉入抑菌培養，10d左右發出毛狀根。由此，建立了北柴胡毛狀根誘導體系。誘導率仍然在10％左右。且文章指出：柴胡毛狀根誘導率是否還可提高有待繼續從菌株和誘導條件等方面摸索。

此外，在《農桿菌誘導北柴胡毛狀根體系建立及UGT基因功能初步研究》(孫晶等，微生物學，2014)一文中，“進行發根農桿菌介導的北柴胡BcUGT10基因的遺傳轉化初步研究”，但結果發現：“誘導產生的毛狀根經25mgm潮霉素篩選獲得3條抗性毛狀根，PCR檢測后，未得到陽性轉化毛狀根”

本發明的目的在于提供一種能夠提高北柴胡毛狀根誘導率，并借以實現外源基因的遺傳轉化的方法。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種提高北柴胡毛狀根誘導效率及遺傳轉化效率的方法及其應用。

本發明采用的技術方案如下：