[發明專利]一種動物來源活性多肽SPGP?V

在審

• 申請號: 201710350579.8
• 申請日: 2017-05-18
• 公開（公告）號: CN107286231A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 長沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種新型動物來源活性多肽及其制備方法，具體涉及一種通過陽離子交換HPLC以及兩步反相HPLC分離獲得新型生物活性多肽的方法。

背景技術

生物毒素是一種重要的生命現象，是生物界在億萬年進化過程中為了生存而形成的，是一個巨大的潛在發現新的生物活性分子的重要資源。目前國際上已經成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關疾病或作為新型藥物的設計參考。蜘蛛產生各種作用于神經系統的神經毒素，其神經毒素根據它們的化學結構分為蛋白多肽類神經毒素和多胺類神經毒素。其中蜘蛛多肽神經毒素最重要，蜘蛛多肽類神經毒素根據它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強神經介質的分泌作用密切相關。蜘蛛毒液已成為神經毒素的一個重要新來源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農業殺蟲劑的較好模式分子。

發明內容

本發明的目的旨在于提供一種從廣西捕鳥蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鈣肽-V（SPGP-V），其氨基酸序列為：

NH₂-Glu Cys Arg Trp Tyr Leu Gly Gly Cys Ser Gln Asp Gly Asp Cys Cys Lys

His Leu Gln Cys His Ser Asn Tyr Glu Trp Cys Val Trp Asp Gly Thr Phe Ser-OH。

所述的蜘蛛抑鈣肽-V的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

所述方法包括：（1）將廣西捕鳥蛛粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/mL的毒素溶液，12 000rpm離心5 min,置于4℃保存。粗毒上樣陽離子交換HPLC進行第一步分離。采用Waters 650型HPLC、美國Pharmacia 公司的Hiprep^TM16/10 CM FF預裝柱進行分離。486檢測器檢測，檢測波長為 215nm。流動相為四相洗脫系統，流速為3 mL/min。洗脫液分別為A相0.1M磷酸二氫鈉, B相0.1M 磷酸氫二鈉, C相 1M氯化鈉, D相雙蒸水（ddH₂O）。其中A液和B液用來調節洗脫液的pH值，采用氯化鈉梯度洗脫。上述經陽離子交換 HPLC分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相HPLC進行進一步純化。（2）反相高效液相色譜分離脫鹽純化：在Pharmacia公司的AKTA蛋白純化系統上完成，采用大連依利特公司的C18反相制備柱。（3）第三步采用分析型Vydac C18 RP-HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于分析型Waters 2690 高效液相色譜儀上進行梯度洗脫，996檢測器檢測，檢測波長為280nm，流動相為含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脫速度為1mL/min，柱溫為40℃。

（2）通過上述陽離子交換HPLC以及兩步反相HPLC共三步分離獲得的SPGP-V，運用質譜鑒定純度達到98%以上，其分子量約為4111.7 Da，經序列測定，該多肽的一級結構由35個氨基酸殘基組成，其中含6個半胱氨酸并形成三對二硫鍵，C-端未酰胺化。多肽SPGP-V純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。

附圖說明

圖1是廣西捕鳥蛛粗毒陽離子交換HPLC圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標表示洗脫峰在280 nm的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。

圖2是廣西捕鳥蛛粗毒目的陽離子交換峰反相HPLC圖譜。“*”表示目的峰，縱坐標表示各個洗脫峰在280 nm下的吸收值，橫坐標表示洗脫時間。

圖3是SPGP-V的反相HPLC圖譜。

圖4是SPGP-V的MALDI-TOF質譜圖譜。

具體實施方式

1、實驗材料和方法

1.1 粗毒的獲取

廣西捕鳥蛛采集于廣西省境內的山區，粗毒毒液采于雌性蛛種。簡述如下：使蜘蛛張開螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10 V的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側3～5 s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時將螯爪有力刺向杯內壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷凍干燥機中經真空冷凍干燥成淺黃色或白色粉末即為粗毒。

1.2粗毒的分級分離及質譜鑒定