[發(fā)明專利]基于ALV?Jgp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710350007.X
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN107058388A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王培坤;林璐璐;秦麗莉;楊永立;李海娟;磨美蘭;韋天超;黃騰;韋平
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K48/00;A61K31/7088;A61P31/14
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于siRNA重組技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法。

背景技術(shù)

J亞群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus，ALV-J)是一種最常見的外源性禽白血病病毒。ALV-J在國內(nèi)的肉用雞、父母代種雞和商品代肉雞中都存在嚴(yán)重感染，已經(jīng)給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的損失，嚴(yán)重危害了我國雞養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。該病可以水平傳播，也可垂直傳播，國外現(xiàn)有的有效經(jīng)驗是將ALV病毒陽性或抗體陽性雞淘汰，以凈化AL，控制AL的傳播。然而，該法凈化周期長，成本高，只能在規(guī)模較大的養(yǎng)殖公司開展。

ALV基因組全長7.6kb～7.8k，基因組結(jié)構(gòu)為：LTR-Leader-gag-pol-env-LTR。主要包含gag、pol和env三個基因。Env基因含有表面蛋白合成的遺傳信息，編碼病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亞單位gp85和跨膜蛋白亞單位gp37。gp85基因編碼ALV的表面糖蛋白，是位于病毒表面的棒狀結(jié)構(gòu)，決定病毒亞群的特異性。gp85是亞群特異性蛋白，負(fù)責(zé)病毒對易感細(xì)胞的吸附，在病毒感染靶細(xì)胞時，病毒的囊膜糖蛋白與靶細(xì)胞表面相應(yīng)的特異性受體相互識別結(jié)合是病毒進(jìn)入靶細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制繁殖所必需的。

由于ALV-J的抗原性易發(fā)生改變，目前還未研發(fā)出可以有效治療或預(yù)防的藥物、疫苗。而腺病毒載體生產(chǎn)工藝簡便、制備純化相對容易、產(chǎn)毒滴度高、外源基因容量大(7Kb～8kb)、腺病毒載體攜帶的外源基因獨立于靶細(xì)胞染色體之外表達(dá)，無插入突變激活癌基因的危險。此外，RNAi是一種強(qiáng)有效的抑制基因功能的工具，該技術(shù)在人類疾病上的應(yīng)用比較多，技術(shù)也比較成熟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體及其制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體的制備方法，利用gp85基因設(shè)計合成siRNA，構(gòu)建形成siRMA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步獲得退火雙鏈DNA后，將其克隆入腺病毒載體pHBAd-U6-RFP構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-gp85-shRNA2，測序鑒定構(gòu)建成功后，在HEK 293細(xì)胞中與骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得重組腺病毒。

上述基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體的制備方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)GenBank上HPRS103毒株(Z46390.1)以及J亞群毒株HG03gp85基因保守區(qū)域為靶序列遵循Renylod規(guī)則，熱動力學(xué)規(guī)則，靶mRNA的二級結(jié)構(gòu)，以及載體pHBAd-U6-RFP的要求，設(shè)計了siRNA，方便連接載體，序列加入EcoR I和BamH I酶切位點；

(2)設(shè)計合成含步驟(1)目的片段的發(fā)夾結(jié)構(gòu)合成shRNA，其中top strand DNA具有序列表SEQ ID NO：2的堿基序列，Bottom strand DNA具有序列表SEQ ID NO：3的堿基序列；將其退火形成雙鏈DNA后連接到酶切好的腺病毒載體pHBAd-U6-RFP，獲得得到重組腺病毒載體pAd-gp85-shRNA2；所述shRNA2具有序列表SEQ ID NO：1的堿基序列；

(3)取重組腺病毒載體質(zhì)粒pAd-gp85-shRNA2和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入HEK 293細(xì)胞即可得到重組腺病毒。

上述制備方法得到的基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體。

上述基于ALV-J gp85基因保守區(qū)域為靶序列的siRNA重組干擾載體在制備干擾體外細(xì)胞及活雞體內(nèi)ALV-J轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的藥物方面的應(yīng)用。