[發明專利]一種用于檢測外周血EGFR基因T790M突變的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201710349780.4
• 申請日: 2017-05-17
• 公開（公告）號: CN107058563A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 齊飛虎;張翼飛
• 申請（專利權）人: 上海默禮生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及分子生物學領域和臨床檢測診斷領域，尤其涉及一種用于檢測外周血EGFR基因T790M突變的試劑盒及其方法。

背景技術

肺癌是當今最常見的惡性腫瘤之一，也是高致死率的癌癥之一，其中80～85％的患者為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)。根據《2012中國腫瘤登記年報》報道，我國癌癥發病率和死亡率分別為286/10萬人和181/10人萬，相當于每分鐘就有5～6個人確診癌癥，平均每5位癌癥患者3個人死亡。在我國所有的腫瘤類別中，肺癌發病率和死亡率高居第一，高達54/10萬人和45/10萬人，換句話說，每分鐘確診的6位癌癥患者中，就有1位是肺癌，并且死亡率極高。

以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)為靶點，實施小分子基因靶點向藥物(如易瑞沙)治療，在非小細胞肺癌的治療中日漸突出。大量研究表明，EGFR突變與TKI療效具有相關性，因此并非所有肺癌患者都可以從TKI(酪氨酸激酶抑制劑)治療中獲益。攜帶EGFR基因突變的NSCLC患者在接受易瑞沙和特羅凱治療時療效顯著，但是研究發現EGFR外顯子20上的T790M突變位點為耐藥位點，會抑制易瑞沙和特羅凱等藥物的療效。同時隨著TKI藥物在臨床的廣泛推廣和應用，約30～40％患者接受TKI治療后出現耐藥現象，進一步檢測發現T790M基因隨之發生突變。因此在服用TKI藥物之后，需要對T790M突變進行定期監控，以幫助醫生選擇最佳的治療方案。

目前大量的文獻和研究證實，通過無創性腫瘤診斷的方法可以進行腫瘤的早期診斷，即通過檢測腫瘤患者外周血中游離的DNA可以檢測到全身各處原發灶的多種異常基因，因此對T790M突變監測可以通過對患者外周血中游離的DNA進行檢測。外周血中游離的DNA為大小不一的DNA片段，從幾bp到幾千bp。但是外周血中游離的DNA在血液中的含量很低，故而T790M突變的DNA含量就更少了，一般從1ml外周血中提取出來的DNA含量低于1ng，約為10～500拷貝左右。目前市場中液體試劑盒的靈敏度和精密度很難達到檢測要求，同時在檢測的過程中加入5～10μL的DNA模板量，實驗結果波動液比較大，因此很多實驗室采用數字PCR(ddPCR)進行檢測。數字PCR精確度很高，但是其對設備要求高，操作過程困難及通量限制使得其在臨床推廣上受到了極大的制約。不僅如此，市場上現有的的試劑產品都為液態試劑，在運輸和保存過程中對于溫度具有嚴格的要求，具有明顯的略勢。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，提供一種檢測外周血中游離DNA的EGFR基因T790M突變的試劑盒及其方法，提高檢測的準確度。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種用于檢測外周血EGFR基因T790M突變的組合物，其包括檢測T790M的引物對和探針，其中，檢測T790M的引物對由SEQ ID NO：1所示序列的上游引物和SEQ ID NO：2所示序列的下游引物組成，檢測T790M的探針為SEQ ID NO：3所示序列。

為了進一步優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：

優選地，上述用于檢測外周血EGFR基因T790M突變的組合物還包括內參引物對和內參探針，其中，所述內參引物對由SEQ ID NO：4所示序列的上游引物和SEQ ID NO：5所示序列的下游引物組成，所述內參探針為SEQ ID NO：6所示序列。

優選地，所有探針的5’-端標記熒光基團，所述熒光基團選自FAM、HEX、VIC、JOE、CY3、TAMRA；所有探針的的3’-端標記淬滅基團，所述淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、TAMRA；其中檢測T790M的探針和內參探針的熒光基團不同；更優選地，檢測T790M的探針5’-端標記FAM，內參探針5’-端標記HEX。

各引物及探針的核苷酸序列如表1所示。

表1引物及探針核苷酸序列表

本發明還提供一種含有上述組合物的用于檢測外周血EGFR基因T790M突變的檢測體系。

優選地，該檢測體系為凍干粉型熒光PCR反應體系，其還包括凍干骨架，凍干保護劑，dNTPs和酶混合液。