[發明專利]一種定量確定微生物中表達的目的蛋白的表達情況的方法

在審

• 申請號: 201710345562.3
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107102050A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 肖玲君
• 申請（專利權）人: 肖玲君
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 北京易光知識產權代理有限公司11596
• 代理人: 李韻

技術領域

本方法發明屬于蛋白表達領域，涉及一種定量確定微生物中表達的目的蛋白的表達情況的方法。

背景技術

在生物蛋白研發及生產過程中，都會涉及到蛋白表達情況的檢測，包括可溶性目的蛋白的表達量，以及可溶性蛋白與包涵體的比例等等。而現如今大部分生物科研院所和生物公司，對蛋白表達情況的檢測，主要是定性的檢測，而且定性檢測效果也不盡如意，比如，蛋白電泳結果不是很糊分不清，就是很淡看不見。嚴重影響對蛋白表達情況的本質把握，不能正確指導后續蛋白表達優化，蛋白放大生產和后續的蛋白分離純化工作，從而造成時間,人力及資源的浪費。

發明內容

有鑒于此，本發明目的是提供一種操作簡單方便，所用到的儀器設備都是生物實驗室常用儀器。從定量的角度上來分析蛋白表達情況，解決現有問題，為后續蛋白表達優化，蛋白放大生產及分離純化提供可靠依據的定量確定微生物中表達的目的蛋白的表達情況的方法。

為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種定量確定微生物中表達的目的蛋白的表達情況的方法，對于一表達了目的蛋白的微生物菌液，總體積為V_總ml,其在波長為600nm的光照下的光吸收值OD₆₀₀為A，從V_總中取出的用于檢測目的蛋白表達情況的菌液體積為V_檢ml。那么，取出的菌液經離心去上清液后，得到菌體沉淀，往菌體沉淀中加入的裂解緩沖液體積為40V_檢A ul。

進一步的，將所述體積為40V_檢A ul的含菌體沉淀的裂解緩沖液混勻，并用超聲破碎儀將菌體破碎后，各取30ul的破菌液于兩個1.5ml EP管中。其中一個EP1管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的全菌液樣品S_全菌；另一個EP2管于高速離心機中離心，將離心后的上清液小心轉入另一個新的EP3管中，并向EP3管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的上清液樣品S_上清；已移除上清液的EP2管中所剩下的沉淀即為包涵體，往已移除上清液的EP2管中包涵體加入與上清液體積相同的裂解緩沖液30ul，并向EP2管中加入10ul的4*蛋白樣品處理液，用于跑變性蛋白電泳的包涵體樣品S_包涵體。

進一步的，所述S_全菌，S_上清，S_包涵體，按同樣方法制得的不含目的蛋白的全菌液樣品S_陰性和已知蛋白濃度的純蛋白S_定量連同蛋白Maker一起跑變性蛋白電泳，上樣量都為V_上樣ul。根據蛋白電泳膠圖結果，可看出目的蛋白在上清液和包涵體中的大致分布，目的蛋白是在上清液中多，還是在包涵體中更多，此即為定性。通過凝膠成像系統分析蛋白電泳膠圖，可得出S_全菌，S_上清，S_包涵體中各自目的蛋白的量與S定量中已知蛋白量的比例，從而得到上樣量都為V_上樣ul的S_全菌，S_上清，S_包涵體里目的蛋白的量分別為m_全菌ug,m_上清ug，m_包涵體ug，其中m_全＝m_上清+m_包涵體。因此，上清液中目的蛋白量與包涵體中目的蛋白總量的比值為d＝m_上清/m_包涵體，其中上清液中的目的蛋白即為可溶性目的蛋白，從而體積為V_總ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的總量M_上清＝160m_上清V_總A/(3V_上樣)ug；體積為V_總ml的微生物菌液中可溶性目的蛋白的濃度為D_上清＝160m_上清A/(3V_上樣)ug/ml。此即為定量分析。

進一步的，所述不含目的蛋白的全菌液樣品S_陰性,即做為實驗的陰性對照，用于判斷目的蛋白是否在實驗組有表達。

進一步的，所述已知蛋白濃度的純蛋白S_定量，即做為實驗的定量標尺，用于定量目的蛋白的量。