[發明專利]一種飼料中110種藥物的篩查方法

有效

• 申請號: 201710345323.8
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107219310B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 吳志明;吳寧鵬;彭麗;張發旺;高延玲;劉占通;陳小鴿;李博
• 申請（專利權）人: 河南省獸藥飼料監察所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 趙磊

1.一種飼料中110種藥物的篩查方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

所述的110種抗菌藥物為：

(a)、大環內酯類：泰樂菌素、替米考星、泰妙菌素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、那他霉素、竹桃霉素、螺旋霉素I、吉他霉素；

(b)、氟喹諾酮類：恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、司帕沙星、諾氟沙星、惡喹酸、培氟沙星、麻保沙星、奧比沙星、氟甲喹、萘啶酸、西諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星、氟羅沙星；

(c)、磺胺類：磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺異噁唑、苯酰磺胺、磺胺硝苯、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺噻唑；

(d)、喹噁啉類：喹烯酮、卡巴氧、乙酰甲喹、喹乙醇；

(e)、β-內酰胺類：氨芐西林、苯唑西林、氟氯西林、頭孢匹林、頭孢噻肟、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢噻呋；

(f)、林可胺類：林可霉素、克林霉素；

(g)、四環素類：土霉素、四環素、金霉素、多西環素；

(h)、酰胺醇類：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；

(i)、硝基呋喃類：呋喃唑酮、呋喃它酮；

(j)、硝基咪唑類：奧硝唑、地美硝唑、異丙硝唑、塞克硝唑、甲硝唑；

(k)、抗球蟲類：氯苯胍、氯羥吡啶；

(l)、苯并咪唑類：非班太爾、氟苯達唑、阿苯達唑、芬苯噠唑、奧苯達唑、奧芬噠唑、噻苯達唑、阿苯達唑砜、甲苯達唑；

(m)、β-受體激動劑：克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、氯丙那林、拉貝特羅、班布特羅、噴布特羅、溴布特羅；

(n)、鎮靜劑類：氯丙嗪、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎哌隆、異丙嗪、賽拉嗪、奧沙西泮、硝西泮、地西泮、奮乃靜；

(o)、抗病毒類：金剛烷胺、金剛乙胺、泛昔洛韋；

(p)、其他：甲氧芐啶、阿托品；

(1)標準工作溶液的配制：

準確稱取各標準品10mg，于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1mg/mL各標準貯備液；對于難溶藥物，恩諾沙星、環丙沙星、諾氟沙星加入少量0.1mol/L HCl溶液，洛美沙星加入少量0.1mol/L NaOH溶液，頭孢喹肟、喹乙醇和喹烯酮加適量二甲基亞砜使其溶解后，用甲醇定至刻度；

分別量取各標準貯備液1mL，于100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為10μg/mL混合標準中間工作溶液；

取混合標準中間工作液0.1mL，用乙腈+水混合液稀釋，制成1μg/mL混合標準工作液；

(2)待測樣品的分析前處理：

1)稱取2±0.02g試樣于50mL離心管中，加入6mL提取液，渦旋30s，振蕩提取10min，以8000r/min的速度離心5min，移取上清液于10mL離心管中；殘渣用4mL乙腈重復提取，離心后合并上清液，作為備用液；

2)氨基固相萃取柱，用6mL乙腈活化，移取備用液過柱，收集流出液，用50％乙腈溶液定容至5mL，混勻，過0.22μm微孔尼龍濾膜；

(3)數據庫建立：

確定110種藥物的分子式和分子量，將110種藥物的混合標準工作液進行液相色譜-串聯質譜測定，得到混合標準工作液的總離子流圖，再把每種藥物的離子色譜圖提取出來，確定每種藥物的保留時間；

將藥物的分子量和保留時間輸入MSMS分析系統，對混合標準工作液進行MSMS分析，得到各藥物的子離子掃描質譜圖，并根據各藥物的碎片的斷裂機理和斷裂難度，確定各藥物的特征碎片離子；

將各藥物的種類、名稱、分子式、保留時間和特征碎片離子信息匯總，建立110種藥物篩查數據庫，如下表所示：

表1數據庫

(4)定性分析：

1)對經過步驟(2)所述方法處理的待測樣品進行液相色譜-串聯質譜分析，將得到的結果與數據庫中的數據進行比較，空白溶劑不能出現與標準溶液相同的離子峰，試樣的母離子及特征碎片離子的精確質量數應與標準溶液的一致，偏差均應≤0.05Da，試樣色譜峰的保留時間，應與標準溶液的保留時間一致，容許偏差為±0.2min，母離子與碎片離子色譜峰的信噪比(S/N)都在3:1以上，信噪比以峰對峰(PtP)計算，全掃描光譜記錄時，試樣中特征碎片離子的相對豐度必須超過標準溶液參照的特征離子光譜豐度的10％，篩選出滿足定性條件的藥物，即為疑似陽性樣品；

2)對于疑似陽性樣品，根據藥物的保留時間和分子量編輯MSMS方法，并采集數據，所得到的疑似物質的子離子掃描質譜圖，與標準溶液的子離子掃描質譜圖進行比較，在相同的條件和相近的濃度下，試樣中主要碎片離子相對豐度與標準溶液的相對豐度的允許偏差不超過下表規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物：

表2主要碎片離子相對豐度與標準溶液的相對豐度的允許偏差

相對離子豐度(％)	>50	>20～50	>10～20	≤10
允許的最大偏差(％)	±20	±25	±30	±50

；

所述步驟(3)和步驟(4)中的液相色譜分析條件為：采用Waters UPLC^TM BEH C18色譜柱，2.1mm×100mm，1.7μm，有機相比例從初始的2％緩慢變化到95％，以保證所有藥物都能有效檢出，梯度洗脫程序見下表3：

表3色譜梯度洗脫程序

注：ESI+：A：0.1％甲酸溶液；B：乙腈，梯度洗脫；

ESI-：A：水；B：乙腈，梯度洗脫；

1為即時變化，6為線性變化；

所述步驟(3)和步驟(4)中的質譜分析條件如下表所示：

表4離子源參數

表5篩查質譜方法參數

注：亮氨酸腦啡肽實時在線分子量校正，分子量為556.2771(ESI+)/554.2615(ESI-)，掃描時間0.5s，掃描間隔10s。