[發(fā)明專利]一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710345264.4
• 申請日: 2017-05-16
• 公開（公告）號: CN107167350B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳麗艷;龔亞菊;鮑銳;黎志彬
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊;于洪

1.一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1）固定與軟化：

選取新鮮茄子植株，截取地上1～3cm處的莖部組織和地下1～3cm處的主根組織作為石蠟切片的試驗材料；

將所選的試驗材料去雜，截成長為0.48～0.52cm的小段，按FAA固定液體積為試驗材料體積的20倍以上計，將試驗材料放入FAA固定液中，于3～5℃下固定3～5d；所述FAA固定液是每100mLFAA固定液中含福爾馬林5mL、冰醋酸5mL、體積濃度為70%的乙醇90mL；

之后，在固定液中再加入體積是固定液體積5%的甘油對試驗材料進行初次軟化，5～7d后，將試驗材料取出，放置于體積比為1：1的甘油與體積濃度為70%的乙醇混合液中，于35～38℃的暗培養(yǎng)箱中進行二次軟化處理15d以上；

步驟（2）脫水：將經(jīng)步驟（1）處理后的試驗材料用體積濃度為30%的乙醇沖洗1～2次，之后將試驗材料放置于體積濃度為50%乙醇中30min，取出后再依次放置在體積濃度為70%、85%、95%的乙醇中各處理2h，最后放置在純乙醇中處理2次，每次30min；

步驟（3）透明：將經(jīng)步驟（2）脫水后的試驗材料置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中1～2h，之后再置于二甲苯中兩次，每次1.5～2h；

步驟（4）浸蠟：將經(jīng)步驟（3）處理的試驗材料浸泡于新的二甲苯中，放入38℃的烘箱中，并不斷提高烘箱溫度，白天每6h升高1℃，晚上每12h升高1℃，同時每2h向二甲苯中添加1～2g石蠟粉末；

當(dāng)烘箱溫度升至56～57℃且溶液體積達到二甲苯體積的2倍以上時，將試驗材料置于石蠟液中處理3次，每次處理24h，且每更換一次石蠟液后烘箱需升溫1℃，最終烘箱溫度為58℃；

步驟（5）包埋：首先對包埋盒及經(jīng)步驟（4）處理的試驗材料進行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為65～71℃，之后，先在包埋盒中加入石蠟液至形成底座，石蠟液的加入量為剛剛覆蓋包埋盒底部即可；3～5s后再向包埋盒中倒入能沒過試驗材料的石蠟液，待底座變白后將試驗材料轉(zhuǎn)入包埋盒中進行包埋，待石蠟液全部凝結(jié)后，將石蠟塊取出，備用；

步驟（6），修蠟與切片：對步驟（5）得到的石蠟塊進行修理，要求將試驗材料周圍多余的蠟塊去除，得到切面平整、截面為矩形或梯形的試驗材料蠟塊；將試驗材料蠟塊切片，切片厚度為8～10μm；

步驟（7），展片與烤片：將蒸餾水與刷過粘片劑的載玻片進行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為40～42℃；然后在載玻片上滴上1mL的蒸餾水，之后將步驟（6）得到切片正面朝上放置在載玻片上展片，再用濾紙將多余的蒸餾水吸除；接著將載玻片放置在40～45℃的烘箱中進行烤片3～7d，待肉眼可見蠟帶已基本融化即完成烤片；

步驟（8），脫蠟：將步驟（7）烤片后的載玻片從烘箱中拿出后立即放入二甲苯浸泡40min，再換成新的二甲苯浸泡至肉眼觀察試驗材料周圍的蠟完全脫去；

步驟（9），復(fù)水：將經(jīng)步驟（8）脫蠟后的載玻片依次放入體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑、純乙醇、體積濃度為95%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為15%乙醇、蒸餾水中，各浸泡2～3min；

步驟（10），染色：將經(jīng)步驟（9）復(fù)水后的載玻片放入質(zhì)量濃度為1%的番紅花紅T水溶液中，于29～31℃的培養(yǎng)箱中放置4～6h，然后依次放置于用蒸餾水、體積濃度為15%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為95%乙醇中，各10s；接著放置于質(zhì)量濃度為1%的固綠溶液中5s，再放置于純乙醇中2次，每次2min；之后放置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2 min，最后放置于二甲苯中2次，每次3～6 min；

步驟（11），封片：將步驟（10）染色的載玻片在二甲苯中沾濕后，用擦鏡紙擦去載玻片底部和周圍多余的二甲苯，在載玻片中央滴入加拿大中性樹膠，輕微晃動玻片讓中性樹膠與二甲苯充分混合，從載玻片一端輕放上蓋玻片，放入35～40℃的烘箱中烤干，得到茄子根莖部組織的永久切片，即可觀察。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，其特征在于，步驟（1）中，去雜時，采用流水沖洗去雜。