[發明專利]一種測定肝微粒體中芍藥苷代謝產物的方法

有效

• 申請號: 201710339439.0
• 申請日: 2017-06-06
• 公開（公告）號: CN106970176B
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 劉玉峰;朱麗君;孫珊珊;胡延喜;徐亮;盧曉丹
• 申請（專利權）人: 遼寧大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

本發明公開了一種測定肝微粒體中芍藥苷代謝產物的方法。屬于醫藥檢測技術領域，本發明方法主要包括以下步驟：芍藥苷肝微粒體的轉化；樣品前處理；液質聯用方法進行肝微粒體中芍藥苷代謝物的測定。本發明的優點在于：操作簡便，樣品處理簡單、分析速度快、特異性強、靈敏度高。該方法可以同時檢測芍藥苷在肝微粒體中更多的代謝產物，且用該分析方法能更多、更準確推測出代謝產物的結構，為研究芍藥苷在肝微粒體中的體外代謝產物提供技術支持，對深入研究活性產物及其作用機制具有重要意義。

技術領域

本發明屬于醫藥檢測技術-生物化學分析領域，具體涉及一種測定肝微粒體中芍藥苷代謝產物的方法。

背景技術

赤芍為我國的傳統中藥材，始記載于《本經》，具有清熱涼血，散瘀止痛的功效，可用于溫毒發斑，跌撲損傷，肝郁肋痛，經閉痛經和臃腫瘡瘍等癥。赤芍中的化學成分較復雜，但赤芍中的單萜苷類成分被認為是赤芍的主要活性成分，主要有芍藥苷等。現代藥理學表明，芍藥苷具有擴張血管、鎮痛鎮靜、抗炎抗潰瘍、解熱解痙、利尿等多種作用。

從當前國內的研究內容看，主要是對赤芍的化學成分、質量控制及藥理作用機制研究為主，涉及赤芍中活性部位芍藥苷的體外代謝結構鑒定研究相對較少。現代藥理學表明，芍藥苷具有很多藥用功效，但口服用藥時，生物利用度很低，有學者推測可能是在體內發生了代謝，代謝產物為發揮藥效部分，因此研究藥物的代謝產物對于深入研究藥物活性產物及其作用機制具有重要意義，對于科學用藥具有指導作用，同時對促進赤芍新藥開發和劑型改進均具有重要意義。肝臟是藥物體內代謝的主要器官，是機體進行生物轉化的主要場所，含有參與藥物代謝龐大的細胞色素P450酶系，是藥物Ⅰ相和Ⅱ相代謝的主要場所。由于藥物體內代謝過程中，原型藥物及其代謝產物的濃度低，體內干擾因素多，而體外代謝研究方法簡單，易控制，能排除內源性物質的干擾、準確找到代謝產物。因此，肝微粒體體外實驗作為體外代謝物研究越來越重要。

常用檢測技術過程時間長，實驗誤差較大，無法做到高通量同時檢測大量的代謝產物，芍藥苷代謝產物結構非常類似，無法用常規檢測方法檢測區分，特異性差。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的空缺，提供了一種測定肝微粒體中芍藥苷代謝產物的方法。本發明的方法具有操作簡便、樣品處理簡單、分析速度快、特異性強、靈敏度高。揭示了中藥赤芍中芍藥苷的體外代謝特征，對了解藥物在體內產生作用的分子形式，了解藥物的代謝機制，推測其作用靶點，進而對赤芍新藥開發和劑型改進具有重要意義。

本發明采用的技術方案為：一種測定肝微粒體中芍藥苷代謝產物的方法，包括以下步驟：

1)肝微粒體中芍藥苷代謝產物的獲得：在培養瓶中，于Tris-HCl緩沖溶液中，加入肝微粒體、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH和MgCl₂，混合均勻，在37℃全溫振蕩器中溫孵5min后，加入芍藥苷的Tris-HCl緩沖溶液，得溫孵體系；溫孵1-3h，溫孵過程中，每20min在液面上通O₂半分鐘，反應后，將培養瓶從振蕩器中取出，迅速加入甲醇終止代謝反應，得芍藥苷代謝產物。

2)樣品處理：將芍藥苷代謝產物渦旋振蕩30s，轉速5000r/min下離心10min，吸取上清液，旋轉蒸干，加入甲醇振蕩復溶，再次離心，吸取上清液，在氮氣下吹干后，殘留物用甲醇復溶，過0.22μm微孔濾膜，進高效液相色譜檢測。

3)樣品測定：芍藥苷代謝產物的檢測，具體條件如下：

色譜條件：色譜柱：Diamonsil^TMODS C₁₈；

流速：0.2mL/min；

柱溫：30℃；

進樣量：1μL；

檢測波長：230nm；