[發(fā)明專利]一種異育銀鯽抗CyHV-2口服重組芽孢疫苗及其制備方法

有效

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• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN107126559B
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發(fā)明（設計）人: 寧德剛;韋瑤;張磊;費倩
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;C12N15/75;A61P31/22
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種異育銀鯽抗CyHV-2口服重組芽孢疫苗，其特征在于，是用異育銀鯽顆粒飼料包被表面展示CyHV-2免疫保護性抗原的重組枯草芽孢桿菌芽孢CyHV-2而制得；所述芽孢是具有萌發(fā)缺陷、無抗生素抗性基因標記的芽孢；且重組枯草芽孢桿菌芽孢通過下述步驟制備：(1)構建重組載體：構建含枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白與CyHV-2免疫保護性抗原融合表達的重組基因、兩側有枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶Xer識別和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌發(fā)的關鍵基因為整合片段的重組載體；所述枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白選自CotB、CotC、CotE、CotG、CotX，CyHV-2保護性抗原選自ORF25B、ORF25，所述控制芽孢萌發(fā)關鍵基因選自gerA、gerB和gerK操縱子，所述枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶Xer識別和切割序列是如SEQ ID NO.25所示的nif序列；(2)將重組載體轉化枯草芽孢桿菌，通過同源重組將融合表達的重組基因整合于染色體中并使芽孢萌發(fā)基因插入失活，并通過切除重組和負篩選獲得無抗生素抗性基因的重組菌株；(3)誘導重組菌株細胞產(chǎn)生萌發(fā)缺陷、無抗生素抗性基因標記以及表面展示CyHV-2免疫保護性抗原的重組芽孢。

2.一種異育銀鯽抗CyHV-2口服重組芽孢疫苗的制備方法，其特征在于，是用異育銀鯽顆粒飼料包被表面展示CyHV-2免疫保護性抗原的、具有萌發(fā)缺陷、無抗生素抗性基因標記的重組枯草芽孢桿菌芽孢而制得；所述重組枯草芽孢桿菌芽孢通過下述步驟制備：(1)構建重組載體：構建含枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白與CyHV-2免疫保護性抗原融合表達的重組基因、兩側有枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶Xer識別和切割序列的抗生素抗性基因、以及以控制芽孢萌發(fā)的關鍵基因為整合片段的重組載體；所述枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白選自CotB、CotC、CotE、CotG、CotX，CyHV-2保護性抗原選自ORF25B、ORF25，所述控制芽孢萌發(fā)關鍵基因選自gerA、gerB和gerK操縱子，所述枯草芽孢桿菌位點特異的重組酶Xer識別和切割序列是如SEQ ID NO.25所示的nif序列；(2)將重組載體轉化枯草芽孢桿菌，通過同源重組將融合表達的重組基因整合于染色體中并使芽孢萌發(fā)基因插入失活，并通過切除重組和負篩選獲得無抗生素抗性基因的重組菌株；(3)誘導重組菌株細胞產(chǎn)生萌發(fā)缺陷、無抗生素抗性基因標記以及表面展示CyHV-2免疫保護性抗原的重組芽孢。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗生素抗性基因指能用于枯草芽孢桿菌重組菌株細胞篩選的基因。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，枯草芽孢桿菌重組菌株是整合性重組載體轉化枯草芽孢桿菌，并依次通過正篩選和負篩選后得到的菌株。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，枯草芽孢桿菌包括能被整合性重組質粒轉化、有位點特異的重組酶Xer的產(chǎn)芽孢菌株。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌是Bacillus subtilisstr.168及其衍生菌株。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將重組芽孢與未經(jīng)油脂噴涂的異育銀鯽顆粒飼料均勻混合、吸附，以一定比例的植物油脂進行包被。