[發(fā)明專利]一種卵形鯧鲹β-胸腺素及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710338455.8
• 申請日: 2017-05-15
• 公開（公告）號: CN107082804B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫云;周永燦;陳曉娟
• 申請（專利權(quán)）人: 海南大學
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C12N15/16;C12N15/70;A61K38/32;A61P31/04
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.卵形鯧鲹β-胸腺素在制備魚類抗細菌疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述卵形鯧鲹β-胸腺素的cDNA 核苷酸的序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2，所述的細菌為緩愛德華氏菌病或無乳鏈球菌病。

2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的卵形鯧鲹β-胸腺素在制備魚類抗細菌疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述卵形鯧鲹β-胸腺素的重組蛋白表達方法為提取卵形鯧鲹的RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA 為模板，以下述序列為引物，通過PCR 獲得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列為：

TroTβ-F ：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’，

TroTβ-R ：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’；

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min；擴增后的片段經(jīng)膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落進行PCR檢測；檢測正確后提取重組質(zhì)粒，EcoRV限制性內(nèi)切酶酶切后回收132bp片段；提取PET-32a質(zhì)粒同時質(zhì)粒經(jīng)EcoRV酶切后，利用T4連接酶將上述132bp回收片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)基因測序驗證含有β-胸腺素基因，將其命名為pTroTβ；

將上述的質(zhì)粒pTroTβ用常規(guī)方法轉(zhuǎn)入表達菌株BL21感受態(tài)細胞中，在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-20小時，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pTroTβ；

將BL21/pTroTβ菌株接種至含50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃條件下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mmol/L進行誘導表達，30℃條件下繼續(xù)以200rpm/min搖動培養(yǎng)6h，而后以5000g，4℃離心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速凍之后，4℃解凍，而后再進行超聲破碎后，以10000g, 4℃離心30min,回收上清液并進行層析柱回收純化得到卵形鯧鲹β-胸腺素蛋白。