[發(fā)明專利]檢測(cè)異源cfDNA的SNP分子標(biāo)記及檢測(cè)方法、用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710334862.1
• 申請(qǐng)日: 2017-05-12
• 公開（公告）號(hào): CN107254514B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊功達(dá);蔣廷亞;曾豐波;胡秀弟;黎小鋒;陳雅文;劉磊;周陽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海奧根診斷技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11;C12M1/34
• 代理公司: 北京三聚陽光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11250
• 代理人: 李靜

1.如表1-2中所示的5764個(gè)SNP位點(diǎn)的組合作為非疾病診斷目的的檢測(cè)異源cfDNA的SNP分子標(biāo)記的用途。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，還包括一種檢測(cè)所述SNP位點(diǎn)的探針，所述探針是基于所述SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)而成的。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述探針包括上游探針和下游探針，所述上游探針的序列是以所述SNP位點(diǎn)為坐標(biāo)起點(diǎn)，向5’方向延伸80bp的堿基序列為序列信息設(shè)計(jì)的；所述下游探針的序列是以所述SNP位點(diǎn)為坐標(biāo)起點(diǎn)，向3’方向延伸80bp堿基序列為序列信息設(shè)計(jì)的。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，還包括一種異源cfDNA的檢測(cè)芯片，所述檢測(cè)芯片包括權(quán)利要求2或3所述的探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，還包括一種單分子標(biāo)記接頭，所述單分子標(biāo)記接頭是由正向序列和反向序列部分配對(duì)后的Y型接頭；所述正向序列由5’端至3’端依次包括5’-接頭和特異性分子標(biāo)簽A；所述反向序列由3’端至5’端依次包括3’-接頭和特異性分子標(biāo)簽B。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述5’-接頭序列的堿基序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示，所述3’-接頭的堿基序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示，所述特異性分子標(biāo)簽A的堿基序列如SEQ ID NO.5所示，所述特異性分子標(biāo)簽B的堿基序列如SEQ ID NO.10所示，其中N代表隨機(jī)堿基。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述正向序列的3’末端連接有堿基T，所述反向序列的5’末端連接有磷酸基團(tuán)。

8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述正向序列如SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示，所述反向序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

9.一種異源cfDNA的非疾病診斷的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)捕獲基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域，所述基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域包括權(quán)利要求1中所述的SNP位點(diǎn)的組合；

(2)將步驟(1)所得的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，所得測(cè)序結(jié)果用于基因組DNA的SNP分型；

(3)篩選步驟(2)中SNP分型后基因型為純合子的SNP位點(diǎn)，作為有效SNP位點(diǎn)；

(4)捕獲cfDNA的目標(biāo)區(qū)域，所述cfDNA的目標(biāo)區(qū)域包括權(quán)利要求1所述的SNP位點(diǎn)的組合；

(5)將步驟(4)所得的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，保留與步驟(3)中所述的有效SNP位點(diǎn)相同坐標(biāo)位置的SNP位點(diǎn)；

(6)檢測(cè)cfDNA在有效SNP位點(diǎn)處區(qū)別于步驟(3)中基因型為純合子SNP信號(hào)，即異源SNP信號(hào)；

(7)計(jì)算步驟(6)中異源SNP信號(hào)占cfDNA在有效SNP位點(diǎn)處總測(cè)序信號(hào)的比例，即得到異源cfDNA的定量結(jié)果。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的異源cfDNA的非疾病診斷的檢測(cè)方法，其特征在于，所述捕獲基因組DNA的目標(biāo)區(qū)域包括如下步驟：

(1)提取血細(xì)胞中的基因組DNA；

(2)將步驟(1)中基因組DNA打斷為DNA片段，所述DNA片段末端修復(fù)后連接權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)中所述的單分子標(biāo)記接頭，得到基因組DNA連接產(chǎn)物；

(3)PCR擴(kuò)增步驟(2)中基因組DNA連接產(chǎn)物，得到基因組DNA文庫；

(4)利用權(quán)利要求4中所述的檢測(cè)芯片捕獲得到步驟(3)中所述基因組DNA文庫的目標(biāo)區(qū)域。