[發明專利]一種VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料的制備方法

在審

• 申請號: 201710330377.7
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107233608A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 吳長應
• 申請（專利權）人: 蕪湖揚展新材料科技服務有限公司
• 主分類號: A61L15/32
• 分類號: A61L15/32;A61L15/20;A61L15/28;A61L15/42;A61L15/44;A61L15/64
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 范奇

技術領域

本發明屬于復合生物材料制備領域，具體涉及一種VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料的制備方法。

背景技術

生物材料發展至今已經經歷了三個主要階段。自20世紀80年代以來，以醫療、保健及增進生活質量等為目的的生物醫用材料取得了快速的發展，已經有超過50種植入器械被應用于臨床，一般來源于技術成熟的工程材料，并且具有生物相容性和缺損組織替代功能，例如已廣泛應用于臨床的心人工血管、人工關節和人工腎等。上述生物醫用材料，具有一個普遍的共性:生物惰性。即生物醫用材料發展所遵循的原則是盡量將受體對植入器械的異物反應降到最低。從上世紀80年代到90年代，生物醫用材料領域的重點逐漸由生物惰性轉向生物活性和可控降解性，開發了第二代生物醫用材料及產品。

20世紀90年代后期，第三代生物材料是伴隨著組織工程學的建立、發展而迅速發展起來的。以組織工程生物材料支架為代表，其綜合了工程科學和生命科學原理，為種子細胞提供了適合其生長、基質合成及發揮其他功能的生物學空間，克服了以往單一的細胞移植中細胞不易成活、基質合成能力低下等缺點，為組織工程化組織的構建提供了細胞載體和結構支架。這類生物醫用材料將生物活性材料與可降解材料這兩個獨立的概念結合起來，在可降解材料上進行分子修飾，引起細胞整合素的相互作用，誘導細胞增殖、分化，以及細胞外基質的合成與組裝。但目前所應用于組織工程的生物材料的性能還有待進一步提高，不能滿足現代醫藥的需求。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料的制備方法，進一步提高了組織修復材料的細胞粘附性及生物活性。

本發明采用以下技術方案：

一種VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：將1ml LB液體培養基和20μL、10％v/v葡萄糖置于離心管中，將1mg pMal-V2/MBP-VEGF加入到離心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震蕩培養過夜，得VEGF懸液；

步驟二：將350mg明膠溶解于60mL水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；

步驟三：將明膠溶液與150mg N-羥基丁二酰亞胺、191mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時后，將溶液置于透析袋中，放入盛有超純水的燒杯中，并置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；

步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機上干燥48h，得粘附性明膠；

步驟五：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用HCl和NaOH調節水溶液pH值至7，即得多巴胺修飾溶液；

步驟六：將3mg/mL的膠原蛋白溶液與10×PBS以4:1的體積比在4℃下充分混勻，用0.1M NaOH調節pH至8,向溶液中加入NaH₂PO₄及NaCl,并使膠原蛋白溶液的終濃度為2mg/mL，NaH₂PO₄的終濃度為10mM，NaCl的終濃度為100mM，然后將溶液轉置35℃水浴反應24h；

步驟七：反應結束后，離心除去上清液，并將沉淀溶于蒸餾水中，透析除鹽，即得纖維化的膠原蛋白溶液；

步驟八：稱取棉短絨，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配制成質量濃度4％的纖維素溶液，所述的氫氧化鋰/尿素水溶液采用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配制而成，并加入膠原蛋白溶液充分攪拌均勻、過濾、靜置24h，于20kV條件下靜電紡絲得膠原蛋白纖維膜；

步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂于膠原蛋白纖維膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次；

步驟十：將膠原蛋白纖維膜浸泡于VEGF懸液中48h得VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料。

步驟一中所述的pMal-V2/MBP-VEGF由理化學研究所伊藤ナノ醫工學研究室提供。

優選的，步驟三中所述的透析袋殘留分子量為10000Da。

優選的，所述的步驟三中超純水用量為漫過透析袋。

優選的，步驟九中噴涂的厚度為5-30nm。

本發明的有益效果在于：