[發明專利]高F值寡肽粗液分離純化方法

在審

• 申請號: 201710329862.2
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107164440A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發明（設計）人: 王斌;趙文浩;趙玉勤;丁冬各
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/14
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明涉及多肽分離純化技術領域，具體是一種高F值寡肽粗液分離純化方法。

背景技術

帶魚（Largehead Hairtail），別稱刀魚、牙帶魚，屬于脊索動物門、鱸形目，體型呈帶狀。主要分布于西太平洋和印度洋，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊并稱為中國的四大海產。

2014年度，舟山市帶魚捕獲量達到108104噸，占主要漁獲品種的比例達到11.52%。舟山帶魚多以新鮮或加工成各種魚制品出售，然而帶魚的開發利用依然處于粗加工階段，高附加值的利用程度較低。

帶魚的平均蛋白含量達到18.4%以上，這使得它成為豐富的蛋白質原材料來源。蛋白質經過酶解等特殊處理，可以制備具備一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我國對帶魚蛋白的研究雖然取得了一些進展，但是還未能開發出高活性的蛋白，還未能更佳充分地開發利用帶魚資源。因此，對帶魚蛋白的深入研究，開發出具備高附加值的帶魚蛋白產品成為迫在眉睫的問題。

高F值寡肽是一類由2-9個氨基酸以獨特的方式組合成的小肽混合物，其主要特征是氨基酸混合物中支鏈氨基酸與芳香族氨基酸比值遠高于人體模式。支鏈氨基酸中的纈氨酸（Val）異亮氨酸（Ile）亮氨酸（Leu）具有維護神經系統正常、增加食欲、治療貧血、促進傷口痊愈等特殊的生理功能。在臨床上，高F值寡肽常用來用來治療肝性腦病，苯丙酮尿癥，改善病人術后的營養狀況等。近年來，國內高F 值寡肽開發方面成為功能食品的研究熱點。如以大豆、玉米、花生等植物為原料，以金槍魚、魷魚、牡蠣等水產品為原料制備的高F值寡肽。目前對于帶魚高F值寡肽的開發研究僅處在實驗室水平的探索，市面上的制成品寥寥無幾。

目前，較為流行和科學的制備高F值寡肽方法是采用雙酶分布酶解法。其主要工藝是首先通過酶解使蛋白肽鏈的芳香族氨基酸殘基位點暴露出來，然后用某些特定蛋白酶酶解切掉芳香族氨基酸，使之以游離態存在于溶液中，再用其他方法最大化去除芳香族氨基酸。制備高F寡肽的關鍵是盡可能的保留支鏈氨基酸（Val、Ile、Leu簡稱BCAA），去除芳香族氨基酸（Tyr、Phe，簡稱AAA），達到BCAA/AAA的摩爾濃度比大于20。

現有技術如授權公告號為CN104004087B的中國發明專利，公開了一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應用，制備方法包括： （1）水蛭干體初步清洗除雜，高速粉碎；（2）原料堿預浸泡；（3）堿性蛋白酶Alcalase AF 2.4L結合木瓜蛋白酶雙酶水解；（4）采用活性炭粉靜態吸附脫除芳香族氨基酸；（5）以凝膠過濾層析柱進一步分離純化，收集分離產物，冷凍干燥 ，獲得分子量低于2000Da，F值（Fischer ratio，即支鏈氨基酸與芳香族氨基酸摩爾含量的比值）高于20的水蛭寡肽粉。該方法制備過程簡單，選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種商業用酶，易于工業生產，產率較高，具有一定的抗凝血效果，并為高F值類產品增加了新來源。該方法游離的芳香族氨基酸清除率不太理想，最后得到的寡肽F不是很高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種成本低廉，操作簡單，能得到芳香族氨基酸含量低，支鏈氨基酸保留率高，即高F值的寡肽粗液分離純化方法。

本發明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：

高F值寡肽粗液分離純化方法，具體步驟為：

預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水沖洗干凈，剪成小塊，按體積比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素E。浸泡，浸泡時間為4~8h。搗碎，過篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，去除油脂，過濾，在42~48℃環境下烘干，得到去脂帶魚粉末；