[發(fā)明專利]一種頂空氣相色譜快速檢測(cè)抗菌紙抑菌性的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710329696.6
• 申請(qǐng)日: 2017-05-11
• 公開（公告）號(hào): CN107271590A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王丹鋒;何亮;柴欣生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/06
• 分類號(hào): G01N30/06;G01N30/16;G01N30/02;C12Q1/18;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司44245
• 代理人: 蔡克永

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及制漿造紙工業(yè)領(lǐng)域，尤其涉及一種頂空氣相色譜快速檢測(cè)抗菌紙抑菌性的方法。

背景技術(shù)

紙張和紙制品是一種與人們的日常生活密切相關(guān)的綠色環(huán)保、可再生的纖維材料。與人體接觸的生活用紙(餐巾紙、衛(wèi)生紙、卸妝紙、吸油紙等)、食品包裝紙、醫(yī)療用紙以及紙幣等在生產(chǎn)、存放及使用過程中，會(huì)引入有害的微生物，如：真菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等，易在使用過程中造成病菌感染而引起腸炎、傷寒、痢疾等疾病。此外，一些比較有價(jià)值的書籍、字畫、證券等紙質(zhì)材料在保存的過程中，也會(huì)逐漸被儲(chǔ)存環(huán)境中的微生物產(chǎn)生的細(xì)菌(主要是霉菌)侵蝕，而造成財(cái)產(chǎn)方面的重大損失。因此，研究開發(fā)具有抗菌、抑菌、殺菌功能的紙產(chǎn)品，已成為當(dāng)前新型紙品開發(fā)的熱點(diǎn)之一。而快速評(píng)價(jià)紙產(chǎn)品的抗菌或抑菌效果的檢測(cè)方法，對(duì)于抗菌紙產(chǎn)品的開發(fā)是非常重要的。

目前，紙張抗菌或抑菌效果的評(píng)價(jià)檢測(cè)方法主要是抑菌圈法。該方法主要用于測(cè)定紙張中的抑菌防霉劑對(duì)細(xì)菌、霉菌以及酵母菌的抑菌作用，其原理是利用抑菌劑在瓊脂平板培養(yǎng)基中擴(kuò)散使其周圍的細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制而形成透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷紙張中抑菌防霉劑的抑菌效果的一種方法。該方法主要缺點(diǎn)是操作繁瑣、耗時(shí)(一般需要將細(xì)菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后才能進(jìn)行測(cè)定)，并且只能進(jìn)行定性或半定量的測(cè)定。為了克服傳統(tǒng)的抑菌圈法評(píng)價(jià)抑菌效果時(shí)準(zhǔn)確度不高、效率低的缺陷，目前已建立一些基于現(xiàn)代儀器的分析方法，如：化學(xué)發(fā)光法、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法等，以及便攜式生物熒光傳感器的細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)。然而，這些方法通常要求樣品中細(xì)菌濃度大于1000個(gè)/mL，以滿足檢測(cè)靈敏度的要求。目前還利用熒光納米粒子標(biāo)記法對(duì)多重細(xì)菌(如鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等)同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速定性檢測(cè)，但是該方法不能用于細(xì)菌數(shù)量的定量分析。

頂空氣相色譜檢測(cè)技術(shù)是一種自動(dòng)的現(xiàn)代化儀器分析技術(shù)，其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品溶液中的揮發(fā)性組分進(jìn)行大批量的高效測(cè)定。早在1997年Gardinia等人就利用頂空氣相色譜法測(cè)定微生物代謝產(chǎn)物——二氧化碳的產(chǎn)生量來監(jiān)測(cè)微生物的細(xì)胞活性和繁殖能力。然而，對(duì)于抗菌紙抑菌性的評(píng)價(jià)方法仍是基于傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)法。因此，有必要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確快速評(píng)價(jià)抗菌紙抑菌性的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，提供一種頂空氣相色譜快速檢測(cè)抗菌紙抑菌性的方法。通過測(cè)定二氧化碳和氧氣信號(hào)值可反映出細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，也可用兩種氣體信號(hào)值來代替其含量高低，進(jìn)而簡(jiǎn)便準(zhǔn)確地計(jì)算出抗菌紙的抑菌率。此外，還可對(duì)大批量的抗菌紙進(jìn)行半自動(dòng)化測(cè)定。

由于大腸桿菌在氧氣存在的條件下，進(jìn)行有氧呼吸，消耗氧氣并釋放出二氧化碳。大腸桿菌有氧呼吸的總反應(yīng)式如式(1)所示。

C₆H₁₂O₆+6O₂+6H₂O→6CO₂+12H₂O+能量 (1)

根據(jù)大腸桿菌在生長(zhǎng)過程中對(duì)氧氣的消耗以及生成的二氧化碳，測(cè)定出兩者信號(hào)值，根據(jù)兩者的變化量即可計(jì)算出抗菌紙的抑菌率。即：

式中，A_d為對(duì)照組檢測(cè)密閉瓶中氣象中二氧化碳或氧氣的峰面積，A_s為實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)密閉瓶中氣象中二氧化碳或氧氣的峰面積，A₀為空白檢測(cè)密閉瓶中氣相中初始二氧化碳或氧氣的峰面積。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

頂空氣相色譜快速檢測(cè)抗菌紙抑菌性的方法，包括如下步驟：

步驟(1)：樣品制備：

制備抗菌紙：將殼聚糖用乙酸溶液溶解，加入硝酸銀溶液，調(diào)pH為弱堿性，抽濾制得殼聚糖凝膠。將殼聚糖凝膠涂布于濾紙表面制得抗菌紙；

制備LB液體和固體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，加入蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓脷溲趸c溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0(±0.2)，高壓滅菌后制得液體培養(yǎng)基。取上述液體培養(yǎng)基加入瓊脂并加熱使其形成溶液，高壓滅菌后制得固體培養(yǎng)基。

制備不同濃度的大腸桿菌菌液：先取市購大腸桿菌菌液培養(yǎng)一定時(shí)間，之后將菌液稀釋，得到不同濃度的菌液，并對(duì)低濃的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù)。

步驟(2)：菌液的培養(yǎng)：

將不同濃度的菌液和抗菌紙裝入頂空瓶并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間，并設(shè)置對(duì)照組(普通濾紙)。

步驟(3)：樣品檢測(cè)：

用頂空氣相色譜檢測(cè)頂空瓶?jī)?nèi)氧氣與二氧化碳信號(hào)值。

步驟(4)：結(jié)果分析：