[發明專利]在線監測用葡萄糖氧化酶絲網印刷電極及其制備方法

有效

• 申請號: 201710329483.3
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN107238645B
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發明（設計）人: 李一葦;史建國;楊俊慧;孟慶軍;馬耀宏;楊艷
• 申請（專利權）人: 山東省科學院生物研究所
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48;C12Q1/00
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張世靜

1.一種在線監測用葡萄糖氧化酶絲網印刷電極，其特征在于，由以下方法制備而成：

1）普魯士藍摻雜的介體型過氧化氫絲網印刷電極制作：

配制含等摩爾濃度K₃Fe(CN)₆和KCl的水溶液，以鹽酸調節其pH在1.0-2.5范圍內，在快速攪拌條件下向其中逐滴加入1-1.33倍體積含等摩爾濃度的FeCl₃水溶液，充分反應后以4000 rpm離心分離獲得深藍色物質即普魯士藍；置于烘箱內于95℃烘干至恒重，再于同一烘箱內于100℃-150℃下烘制0.5-2h，得到活化的普魯士藍，干燥器內冷卻后以研缽研細成顆粒待用；稱取普魯士藍顆粒0.05g，配和入1mL N,N-二甲基甲酰胺以研缽研細，隨后加入3g導電碳漿 和2mL導電碳漿專用溶劑精細研磨20min使物料充分混勻，制成普魯士藍摻雜的碳基導電油墨；

取厚度為0.5 mm的聚氯乙烯基片，以1 mol/L NaOH溶液浸泡處理4 h后洗凈晾干；制作普魯士藍摻雜絲網印刷電極：

（1）首先，在洗凈的聚氯乙烯基片上以導電碳漿印制導線及兩個電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內使有機溶劑充分揮發；

（2）兩個電極中取其中一個作為對電極，另一個電極上印制普魯士藍摻雜的碳基導電油墨成工作電極，印刷完成后，置于90℃的烘箱內使有機溶劑充分揮發并使基底電極得到活化；

（3）最后以環氧樹脂印制環氧樹脂絕緣層，覆蓋其導電部分，僅暴露出其工作面積、對電極及同檢測器連接的導電部；印刷完成后，置于90℃的烘箱內使有機溶劑充分揮發；

2）酶固定化載體制備

以含有0.1 mol/L冰乙酸的水溶液在90℃條件下溶解固體聚乙烯亞胺PEI獲得質量濃度為1.0-2.0 wt%的聚乙烯亞胺水溶液，冷卻后過濾得純凈的聚乙烯亞胺溶膠；

取1.0-2.0 wt%聚乙烯亞胺溶膠，在磁力攪拌條件下逐滴滴加入含量為20-500倍聚乙烯亞胺干重的戊二醛GA水溶液中進行充分反應，所用戊二醛為質量分數為25%-50%的水溶液，反應時間為12-16h得到PEI-GA合成母液；

為去除PEI-GA合成母液內的戊二醛以獲得純凈的PEI-GA，使用截留分子量為8-50 kDa的透析袋進行2-3d的透析，其間每隔4-6h更換一次透析液，所用透析液為0.01-0.1 mol/L的Na₂Ac-HAc緩沖液；或以乙醚或三氯甲烷為萃取劑對合成母液進行反復透析后，與萃取產物等體積的0.01-0.1 mol/L的Na₂Ac-HAc緩沖液混合；或以截留分子量為3-50 kDa的超濾膜進行超濾；

3）固定化葡萄糖氧化酶PEI-GA-GOx的制備及酶電極的制作

（1）取2.5-3份體積的純化PEI-GA以0.01-0.1 mol/L的Na₂Ac-HAc緩沖液稀釋成PEI-GA含量為0.1-0.5wt%的稀溶液；

（2）以0.01-0.1 mol/L的Na₂Ac-HAc緩沖液配制含300-340 U/mL的GOx酶稀釋液，取0.8-1份與步驟（1）所述的溶液均勻混合并靜置0-30 min，于4℃、2000-6000 rpm條件下離心5-10 min，收集其沉淀部分待用；

（3）將沉淀部分以5-6份體積0.01-0.1 mol/L Na₂Ac-HAc的緩沖液重新分散，再將分散液同1.7-3.4份體積0.01-0.1 mol/L Na₂Ac-HAc緩沖液配置的含1-3 wt%的羧基化聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素鈉、牛血清蛋白或其混合物均勻混合，靜置0-30 min后所得懸濁液即經固定化修飾后的酶制劑；

（4）將25-50 μL該懸濁液滴加于介體摻雜的絲網印刷電極片工作面積上成固定化酶層，于室溫條件下靜置3-4小時；以切割成合適尺寸的纖維素濾紙或玻璃纖維素濾紙為保護膜緊密覆蓋電極片的工作面積，以雙面膠密封后成為成品酶電極。