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[發(fā)明專利]一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效率的方法在審

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201710326824.1 申請日: 2017-05-10
公開(公告)號: CN107151656A 公開(公告)日: 2017-09-12
發(fā)明(設(shè)計)人: 鄭輝;楊肖;陳金龍;何松蔚 申請(專利權(quán))人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
主分類號: C12N5/079 分類號: C12N5/079;C12N15/867;C12N5/10
代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12211 代理人: 張會雪
地址: 510530 廣東*** 國省代碼: 廣東;44
權(quán)利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 提高 體細(xì)胞 神經(jīng)細(xì)胞 分化 效率 方法
【權(quán)利要求書】:

1.一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,其特征在于:該方法包括如下步驟:通過逆轉(zhuǎn)錄病毒使轉(zhuǎn)錄因子在體細(xì)胞過表達(dá)之后再使用無血清培養(yǎng)基去誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變;所述的轉(zhuǎn)錄因子包括Sox2,Stat3,Slug,F(xiàn)oxO1,Doublecortin(DCX)中的一種或兩種以上的組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,其特征在于:該方法包括如下步驟:

(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒的過表達(dá)載體;

(b)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞plat-E包裝出相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒;

(c)準(zhǔn)備體細(xì)胞,并用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染細(xì)胞;

(d)用無血清培養(yǎng)基,在細(xì)胞生長的條件下,培養(yǎng)已感染了病毒的細(xì)胞,以獲得神經(jīng)細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,其特征在于:所述的體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞或大小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;更優(yōu)選地,所述的體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞,更優(yōu)選地,所述的小鼠成纖維細(xì)胞的來源為胎鼠。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,其特征在于:該方法還包括如下步驟:

(e)檢測并且分析經(jīng)誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)細(xì)胞;

(f)于神經(jīng)細(xì)胞生長的條件下繼續(xù)培養(yǎng)步驟(e)中的神經(jīng)細(xì)胞;

優(yōu)選地,所述步驟(e)中檢測并且分析經(jīng)誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)細(xì)胞包括,免疫熒光或者流式細(xì)胞分選確定在獲得細(xì)胞中一個或者多個神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物(TuJ,MAP2,NeuN等)的表達(dá)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,其特征在于:所述的轉(zhuǎn)錄因子至少包括Stat3;更優(yōu)選地,所述的轉(zhuǎn)錄因子為Stat3和Sox2組合,或者是Stat3和FoxO1組合,或者是Stat3、Sox2和FoxO1組合中的一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法,所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、代血清添加劑、酪氨酸激酶類生長因子、小分子化合物和LIF;所述代血清添加劑包括N2和/或B27,所述酪氨酸激酶類生長因子包括bFGF和/或EGF,所述小分子化合物包括維生素C;

其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM),Minimal Essential Medium(MEM),Basal Medium Eagle(BME),F(xiàn)-10,F(xiàn)-12,RPMI 1640,Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM),αMinimal Essential Medium(αMEM),Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)中的一種或兩種以上的混合物。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12的混合物,更優(yōu)選地,所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12體積比為1:1的混合物。

所述代血清添加劑為N2、B27、或者是N2和B27的混合物;優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中N2的濃度在0%-1%之間,B27的濃度在0%-2%之間,但N2、B27不同時為零;更優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中N2的濃度為1%,不包含B27;%均指體積濃度。

所述酪氨酸激酶類生長因子為bFGF、EGF,或者是bFGF和EGF的混合物;優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度在0-40ng/ml之間,EGF的濃度在0-40ng/ml之間,但bFGF、EGF不同時為零;更優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度為20ng/ml,不包含EGF。

所述小分子化合物為維生素C;優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中,維生素C的濃度在10-200μg/ml之間;更優(yōu)選地,在最終培養(yǎng)基中維生素C的濃度為50μg/ml。

在最終培養(yǎng)基中,所述LIF的濃度為:0.01μg/ml。

所述培養(yǎng)基還包含適于細(xì)胞生長的其它組分,其中其它組分選自L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸鈉和2-巰基乙醇中的一種或兩種以上的組合。

7.一種轉(zhuǎn)錄因子組合,其特征在于:該組合包括:

Stat3;

Sox2、Slug、FoxO1、Doublecortin(DCX)中的一種或兩種以上。

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