[發(fā)明專利]一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效率的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710326824.1
• 申請日: 2017-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN107151656A
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭輝;楊肖;陳金龍;何松蔚
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號(hào): C12N5/079
• 分類號(hào): C12N5/079;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司12211
• 代理人: 張會(huì)雪

1.一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒使轉(zhuǎn)錄因子在體細(xì)胞過表達(dá)之后再使用無血清培養(yǎng)基去誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變；所述的轉(zhuǎn)錄因子包括Sox2，Stat3，Slug，F(xiàn)oxO1，Doublecortin(DCX)中的一種或兩種以上的組合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(a)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒的過表達(dá)載體；

(b)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞plat-E包裝出相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒；

(c)準(zhǔn)備體細(xì)胞，并用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染細(xì)胞；

(d)用無血清培養(yǎng)基，在細(xì)胞生長的條件下，培養(yǎng)已感染了病毒的細(xì)胞，以獲得神經(jīng)細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，其特征在于：所述的體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞或大小鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；更優(yōu)選地，所述的體細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞，更優(yōu)選地，所述的小鼠成纖維細(xì)胞的來源為胎鼠。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，其特征在于：該方法還包括如下步驟：

(e)檢測并且分析經(jīng)誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)細(xì)胞；

(f)于神經(jīng)細(xì)胞生長的條件下繼續(xù)培養(yǎng)步驟(e)中的神經(jīng)細(xì)胞；

優(yōu)選地，所述步驟(e)中檢測并且分析經(jīng)誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)細(xì)胞包括，免疫熒光或者流式細(xì)胞分選確定在獲得細(xì)胞中一個(gè)或者多個(gè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物(TuJ，MAP2，NeuN等)的表達(dá)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，其特征在于：所述的轉(zhuǎn)錄因子至少包括Stat3；更優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)錄因子為Stat3和Sox2組合，或者是Stat3和FoxO1組合，或者是Stat3、Sox2和FoxO1組合中的一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述一種提高體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率的方法，所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、代血清添加劑、酪氨酸激酶類生長因子、小分子化合物和LIF；所述代血清添加劑包括N2和/或B27，所述酪氨酸激酶類生長因子包括bFGF和/或EGF，所述小分子化合物包括維生素C；

其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)，Minimal Essential Medium(MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F(xiàn)-10，F(xiàn)-12，RPMI 1640，Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)，αMinimal Essential Medium(αMEM)，Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)中的一種或兩種以上的混合物。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12的混合物，更優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM和F12體積比為1:1的混合物。

所述代血清添加劑為N2、B27、或者是N2和B27的混合物；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中N2的濃度在0％-1％之間，B27的濃度在0％-2％之間，但N2、B27不同時(shí)為零；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中N2的濃度為1％，不包含B27；％均指體積濃度。

所述酪氨酸激酶類生長因子為bFGF、EGF，或者是bFGF和EGF的混合物；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度在0-40ng/ml之間，EGF的濃度在0-40ng/ml之間，但bFGF、EGF不同時(shí)為零；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中bFGF的濃度為20ng/ml，不包含EGF。

所述小分子化合物為維生素C；優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中，維生素C的濃度在10-200μg/ml之間；更優(yōu)選地，在最終培養(yǎng)基中維生素C的濃度為50μg/ml。

在最終培養(yǎng)基中，所述LIF的濃度為：0.01μg/ml。

所述培養(yǎng)基還包含適于細(xì)胞生長的其它組分，其中其它組分選自L-谷氨酰胺、NEAA、丙酮酸鈉和2-巰基乙醇中的一種或兩種以上的組合。

7.一種轉(zhuǎn)錄因子組合，其特征在于：該組合包括：

Stat3；

Sox2、Slug、FoxO1、Doublecortin(DCX)中的一種或兩種以上。