[發(fā)明專利]一種基于適配體修飾磁珠和金納米顆粒模擬酶活性檢測(cè)卡那霉素的比色分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710324530.5
• 申請(qǐng)日: 2017-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN107238699A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周楠迪;王春帥;姚斌斌;田亞平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32104
• 代理人: 時(shí)旭丹,張仕婷

1.一種基于適配體修飾磁珠和金納米顆粒模擬酶活性檢測(cè)卡那霉素的比色分析方法，其特征是步驟為：利用酪氨酸作為還原劑制備具有類過氧化物酶的金納米顆粒模擬酶AuNPs；采用與卡那霉素特異性適配體互補(bǔ)的cDNA修飾金納米顆粒獲得功能化金納米顆粒AuNPs-cDNA；利用鏈霉親和素修飾的磁珠和生物素修飾的卡那霉素適配體制備適配體修飾的磁珠MBs-aptamer；通過適配體和cDNA的互補(bǔ)雜交制備出MBs-aptamer-cDNA-AuNPs復(fù)合物；在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，將含不同濃度的卡那霉素的樣品與復(fù)合物混合，卡那霉素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體并釋放出AuNPs-cDNA；磁性分離去除磁珠和仍結(jié)合在磁珠上的AuNPs后，往上清液中加入顯色底物，通過分光光度測(cè)定繪制得到吸光度與卡那霉素濃度的線性關(guān)系；以同樣的試劑和步驟對(duì)蜂蜜樣品中的卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于適配體修飾磁珠和金納米顆粒模擬酶活性檢測(cè)卡那霉素的比色分析方法，其特征是具體步驟如下：

（1）金納米顆粒模擬酶AuNPs的制備：將含有0.1~0.5 mM酪氨酸和0.1~0.5 mM KOH的300 mL超純水溶液煮沸3~5 min，立即加入1.02 mL質(zhì)量體積濃度為1%~3%的氯金酸溶液并在沸水浴中保溫5~10min；繼續(xù)在沸水浴中持續(xù)沸騰至溶液體積減少至30 mL，得到金納米顆粒溶液；將上述金納米顆粒溶液在截留分子量為12 kDa的透析袋中透析除去多余的KOH、金屬離子及酪氨酸，得金納米顆粒模擬酶AuNPs，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）功能化金納米顆粒AuNPs-cDNA的制備：所有用到的試劑瓶和Ep管都用12 M NaOH溶液浸泡10 h以上，并用大量水沖洗；取400 μL 1 μM 巰基修飾的cDNA-SH經(jīng)過95℃ 10 min，冰浴5 min處理后，與50 μL 10 mM三-(2-羧乙基)膦鹽酸鹽TCEP在室溫下孵育1 h；將上述混合溶液與5mL 金納米顆粒模擬酶AuNPs溶液混合，在搖床上100 rpm、10℃下震蕩2 h后，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，黑暗靜置16 h以上；加入500 mM pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，直至Tris濃度為5 mM；然后向上述溶液中逐滴加入 400 μL 1 M的NaCl溶液，靜置5~10 min，8000~12000 rpm離心8 min，除去未結(jié)合的cDNA，最后用5mM pH 7.5的PBS緩沖液重懸得到功能化金納米顆粒AuNPs-cDNA，4℃黑暗環(huán)境下保存時(shí)間為2周；

所述cDNA序列為5’-HS-CAAAAGTCGG CTTAG-3’；

（3）MBs-aptamer-cDNA-AuNPs復(fù)合物的構(gòu)建：將磁珠瓶放到漩渦振蕩器上振蕩20s，重懸修飾有鏈霉親和素的磁珠；用移液器吸取100 μL 1mg/mL的磁珠溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，將離心管置于磁性分離器上，靜置1 min，用移液器吸去上清液，從磁性分離器上取下離心管；用buffer I將磁珠稀釋至濃度為1 mM，將50 μL 1 mM 磁珠與100 μL 500 mM生物素修飾的卡那霉素適配體混合充分振蕩，室溫下孵育30 min后，加入50 μL 體積濃度為2%的BSA，室溫下孵育1h以封閉磁珠暴露的表面防止非特異性吸附的發(fā)生；磁性分離，去上清，用1×PBS buffer沖洗磁珠三次，以除去未結(jié)合的卡那霉素適配體aptamer；磁性分離后，用200 μL 1×PBS buffer重懸，即為MBs-aptamer；將200 μL MBs-aptamer與200 μL AuNPs-cDNA室溫下混合孵育30min，后經(jīng)過磁性分離，用1×PBS buffer沖洗磁珠三次，除去未能互補(bǔ)結(jié)合在磁珠上的AuNPs-cDNA，最后用2mM、pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行重懸得到MBs-aptamer-cDNA-AuNPs復(fù)合物；

卡那霉素適配體kanamycin aptamer，簡(jiǎn)稱aptamer，序列為5’-biotin-TGGGGGTTGA GGCTAAGCCG A -3’；

（4）卡那霉素的檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：選擇不同濃度的卡那霉素溶液，加入到MBs-aptamer-cDNA-AuNPs復(fù)合物體系中，通過50 min置換反應(yīng)，將cDNA-AuNPs從復(fù)合結(jié)構(gòu)置換下來，其自身與aptamer形成特異結(jié)構(gòu)；通過磁性分離后，將含游離的cDNA-AuNPs的上清液取出轉(zhuǎn)移至另外一支Ep管內(nèi)，在反應(yīng)pH4~6，反應(yīng)溫度30~50℃，反應(yīng)時(shí)間8 min下，加入20 μL 25~50 mM TMB和20 μL質(zhì)量濃度3%~5% H₂O₂進(jìn)行催化反應(yīng)；用10~50 μL 2 M H₂SO₄作為終止液來終止反應(yīng)；

將上述反應(yīng)體系5000~8000 rpm離心2~5 min，對(duì)上清進(jìn)行300~600 nm波長(zhǎng)掃描并根據(jù)不同濃度的卡那霉素溶液與450 nm處的吸光值之間的關(guān)系，繪制出相應(yīng)的線性關(guān)系圖譜；

（5）實(shí)際樣品中卡那霉素的檢測(cè)：將不同濃度卡那霉素溶液添加至洋槐蜂蜜中制備得到人工污染卡那霉素的蜂蜜，取其中1 mL和2mM、pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液4 mL混合，稀釋5倍后作為檢測(cè)樣品，在與標(biāo)準(zhǔn)品相同的條件下進(jìn)行檢測(cè)。