[發明專利]表達載體元件組合、新的生產用細胞產生方法及其在重組產生多肽中的用途

在審

• 申請號: 201710324350.7
• 申請日: 2012-12-19
• 公開（公告）號: CN107119073A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: P·M·許爾斯曼;H·克內根
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅切有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/13;C07K16/00;C07K16/28
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 凌立,黃革生

1.用于選擇重組瞬時轉染哺乳動物細胞的方法，其包括以下步驟：

a)用包含以下的表達載體轉染哺乳動物細胞：

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼抗體輕鏈的核酸、bGH polyA信號序列和hGT終止子序列的第一表達盒；

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼抗體重鏈的核酸、bGH polyA信號序列和hGT終止子序列的第二表達盒；以及

由此第一表達盒和第二表達盒雙向排列，

從而獲得大量重組哺乳動物細胞；

b)從所述大量重組哺乳動物細胞選擇(單個)瞬時轉染的重組哺乳動物細胞。

2.權利要求1的方法，其特征在于所述編碼抗體輕鏈的核酸和/或所述編碼抗體重鏈的核酸包含至少一個內含子。

3.權利要求1至2任一項的方法，其特征在于所述編碼抗體輕鏈的核酸和/或所述編碼抗體重鏈的核酸是cDNA。

4.權利要求1至3任一項的方法，其特征在于所述表達質粒進一步包含選擇標記。

5.權利要求1至4中任一項的方法，其特征在于所述表達盒按LC-HC-SM順序排列。

6.權利要求1至5中任一項的方法，其特征在于所述哺乳動物細胞選自CHO細胞、HEK細胞、BHK細胞、NS0細胞和SP2/0細胞。

7.權利要求1至6中任一項的方法，其特征在于所述哺乳動物細胞是用于選擇瞬時轉染的細胞的HEK細胞。

8.權利要求1至7中任一項的方法，其特征在于所述表達載體包含：

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第一抗體輕鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第一表達盒；

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第二抗體輕鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第二表達盒；

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第一抗體重鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第三表達盒；

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第二抗體重鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第四表達盒；

或

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼抗體輕鏈的核酸、bGH polyA信號序列和hGT終止子序列的第一表達盒；

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第一抗體重鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第二表達盒；和

-按5’至3’方向包含hCMV啟動子、編碼第二抗體重鏈的核酸、bGHpolyA信號序列和hGT終止子序列的第三表達盒；

由此所述抗體輕鏈是兩條抗體重鏈的共同輕鏈。

9.權利要求1至8中任一項的方法，其特征在于所述表達載體編碼雙特異性抗體。

10.權利要求8或9的方法，其特征在于所述雙特異性抗體具有特異性結合第一抗原或抗原上的第一表位的第一結合特異性或結合部位，且所述雙特異性抗體具有特異性結合第二抗原或抗原上的第二表位的第二結合特異性或結合部位。

11.權利要求8至10中任一項的方法，其特征在于所述表達載體包含：

-抗體輕鏈表達盒；

-第一抗體重鏈表達盒；

-第二抗體重鏈表達盒；和

-選擇標記表達盒。

12.權利要求8至11中任一項的方法，其特征在于所述表達載體包含：

-第一抗體輕鏈表達盒；

-第二抗體輕鏈表達盒；

-第一抗體重鏈表達盒；

-第二抗體重鏈表達盒；和

-選擇標記表達盒。

13.權利要求8至12中任一項的方法，其特征在于所述抗體重鏈表達盒之一編碼包含臼突變的抗體重鏈。

14.權利要求8至13中任一項的方法，其特征在于所述抗體重鏈表達盒之一編碼包含杵突變的抗體重鏈。

15.權利要求8至14中任一項的方法，其特征在于所述抗體輕鏈表達盒之一編碼包含抗體輕鏈可變結構域和作為恒定結構域的抗體重鏈CH1結構域的抗體輕鏈變體，和/或所述抗體輕鏈表達盒之一編碼包含抗體輕鏈可變結構域和作為恒定結構域的抗體輕鏈CL結構域的抗體輕鏈。