[發明專利]單個甲藻孢囊分子鑒定的方法

在審

• 申請號: 201710323825.0
• 申請日: 2017-05-10
• 公開（公告）號: CN107523613A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 董燕紅;戰愛斌;高養春;方宏達;李海濤
• 申請（專利權）人: 國家海洋局南海環境監測中心;中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，包括：

獲取甲藻孢囊破碎液；

以所述甲藻孢囊破碎液為模板，以序列為GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸為外引物的上游引物，以序列為TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸為外引物的下游引物，進行第一聚合酶鏈式反應擴增，獲取第一擴增產物，以根據所述第一擴增產物確定所述甲藻孢囊的物種。

2.根據權利要求1所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

根據所述第一擴增產物確定所述甲藻孢囊的物種，包括：

對所述第一擴增產物進行測序，以確定所述甲藻孢囊的物種。

3.根據權利要求1所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

進行所述第一聚合酶鏈式反應擴增時，聚合酶鏈式反應體系配比如下：

所述甲藻孢囊的破碎液10微升，緩沖液2.5微升，鎂離子2.0微升，所述外引物的上游引物20納克，所述外引物的下游引物20納克，Tag酶1.5U。

4.根據權利要求1或2或3所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

進行所述第一聚合酶鏈式反應擴增，包括：

步驟一：擴增溫度為95℃，擴增時間為5分鐘；

步驟二：依次按照以下參數進行聚合酶鏈式反應擴增循環，循環次數為30次：

擴增溫度95℃、擴增時間30秒，擴增溫度57℃、擴增時間45秒，擴增溫度72℃、擴增時間60秒；

步驟三：擴增溫度72℃、擴增時間7分鐘；

即得所述第一擴增產物。

5.根據權利要求1或2或3所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

在獲取第一擴增產物之后，還包括：

對所述第一擴增產物采用質量含量為2％的瓊脂或瓊脂糖進行凝膠電泳反應，觀測反應物，如果反應物的條帶不滿足預定要求，則還包括：

以序列為GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸為內引物上游引物，以序列為TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸為內引物下游引物，對所述第一擴增產物進一步進行第二聚合酶鏈式反應擴增，獲取第二擴增產物，以對所述第二擴增產物進行測序，以確定所述甲藻孢囊的物種；

否則，直接對所述第一擴增產物進行測序，以確定所述甲藻孢囊的物種。

6.根據權利要求5所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

進行所述第二聚合酶鏈式反應擴增，包括：

步驟四：擴增溫度為95℃，擴增時間為5分鐘；

步驟五：依次按照以下參數進行聚合酶鏈式反應擴增循環，循環次數為30次：

擴增溫度95℃、擴增時間30秒，擴增溫度57℃、擴增時間45秒，擴增溫度72℃、擴增時間45秒；

步驟六：擴增溫度72℃、擴增時間7分鐘；

即得所述擴增產物。

7.根據權利要求1所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，還包括：

從海底沉積物中分離出單個甲藻孢囊，避光保存備用；

破碎所述甲藻孢囊；

將所述甲藻孢囊的破碎液轉入聚合酶鏈式反應管。

8.根據權利要求1所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

獲取甲藻孢囊破碎液，包括：

從海底沉積物中分離出單個甲藻孢囊；

破碎所述甲藻孢囊，獲取所述甲藻孢囊破碎液。

9.根據權利要求8所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

從海底沉積物中分離出單個甲藻孢囊，包括：

取海洋沉積物樣品溶于過濾海水或人工海水中，得到樣品液，對所述樣品液進行超聲處理；

篩絹網過濾超聲處理后的所述樣品液，截留顆粒物，對截留顆粒物懸浮處理后獲得含懸浮顆粒物的液體；

通過顯微鏡，自所述含懸浮顆粒物的液體中尋找單個孢囊，吸取含單個所述甲藻孢囊的液體，轉移到聚合酶鏈式反應管中；

自含單個所述甲藻孢囊的液體中，分離出所述甲藻孢囊。

10.根據權利要求9所述的單個甲藻孢囊分子鑒定的方法，其特征是，

篩絹網過濾超聲處理后的所述樣品液，包括：

依次采用130微米、20微米孔徑的所述篩絹網過濾所述樣品液，取截留在所述20微米孔徑所述篩絹網上的顆粒物，至表面皿渦旋后取包含懸浮顆粒物的液體即得。