[發明專利]一種敲除PD-1的T細胞制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201710322510.4
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107699591B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 劉明錄;馮建海;張傳鵬;強邦明;金海鋒;萬磊;韓慶梅
• 申請（專利權）人: 山東興瑞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 山東華君知識產權代理有限公司 37300
• 代理人: 武歡歡

1.一種敲除PD-1的異質T淋巴細胞的制備方法，其特征在于：在PD-1的基因序列中選取19個堿基序列作為靶點，構建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1質粒，利用慢病毒包裝體系將PD-1基因包裝到慢病毒中，將攜帶PD-1基因的慢病毒感染單核細胞誘導的異質T淋巴細胞，得到敲除 PD-1基因的異質T淋巴細胞；所述19個堿基序列為序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

2.如權利要求1所述的一種敲除PD-1的異質T淋巴細胞的制備方法，其特征在于，所述單核細胞誘導的異質T淋巴細胞如下制備：取患者自身的外周血，分離單個核細胞，用含有重組干擾素γ的Lymphocyte Serum-free Medium KBM 551培養基誘導培養24小時后，加入重組白細胞介素-2和OKT-3誘導繼續培養24小時；每隔三天倍比加含有重組白細胞介素-2的培養基，同時加入5％的患者自體血漿，培養至第14天，流式細胞術檢測CIK細胞的分子標記 CD3+、CD56+的陽性表達率；當CD3+陽性率＞80％，CD3+CD56+雙陽性率＞20％，視為CIK誘導成功，收獲患者自體單核細胞誘導的異質T淋巴細胞，用于慢病毒感染。

3.如權利要求1所述的一種敲除PD-1的異質T淋巴細胞的制備方法，其特征在于，將所述攜帶PD-1基因的慢病毒感染單核細胞誘導的異質T淋巴細胞如下操作：所述pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1質粒和慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒共同轉染293T細胞，所述293T細胞內PD-1基因被包裝成慢病毒顆粒，釋放到細胞外，收集含有慢病毒的上清，并用收集到的上清感染誘導的異質T淋巴細胞。

4.如權利要求1所述的一種敲除PD-1的異質T淋巴細胞的制備方法，其特征在于，所述敲除 PD-1的基因靶點片段通過基因合成技術合成。

5.一種治療癌癥的藥物，其特征在于：含有權利要求1中所述的敲除PD-1的異質T淋巴細胞。

6.權利要求1中所述的敲除PD-1的異質T淋巴細胞在制備治療惡性腫瘤的藥物中的用途。

7.如權利要求6所述的制備治療惡性腫瘤的藥物的用途，其特征在于：所述惡性腫瘤為胃癌，腸癌，胰腺癌，間皮瘤，肺癌，乳腺癌和卵巢癌。