[發(fā)明專利]一種對ncRNA檢測結(jié)果進行標準化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710322017.2
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107099593B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧友平;王紅衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 上海匯真生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 11760 北京前審知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 張波濤;李鋒

本發(fā)明涉及一種對生物樣本中ncRNA的檢測結(jié)果進行標準化的方法，其特征在于在結(jié)果判斷中使用兩個ncRNA的比值作為檢測分類的指標,并且所述方法不依賴于任何內(nèi)源對照或外源對照的使用。所述方法相對于內(nèi)源對照標準化法、外源對照標準化法能夠提高ncRNA檢測結(jié)果的邏輯真實性。本發(fā)明還具體提供了選擇肺腺癌相關(guān)ncRNA對的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測方法領(lǐng)域，具體涉及一種對生物定量檢測結(jié)果進行處理、分析的方法，更具體涉及一種基于比率對生物樣本中ncRNA的檢測結(jié)果進行標準化的方法，特別涉及一種對肺腺癌相關(guān)ncRNAs的檢測結(jié)果進行標準化化處理以提高其邏輯真實性的方法。

背景技術(shù)

肺癌是一種常見的疾病，其最具異質(zhì)性，是男性癌癥的頭號殺手，此外肺癌極易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)和遠處器官轉(zhuǎn)移。每年世界上肺癌新發(fā)病例占所有新發(fā)癌癥的17％，死亡人數(shù)占癌癥死亡人數(shù)的23％。在中國肺癌是最常被檢測到的的癌癥也是癌癥死亡的首要原因，在60-74歲男性中肺癌是新發(fā)病例最多且癌癥死亡數(shù)最多的癌癥。肺癌可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(Non-small cell Lung Cancer,NSCLC)，其中NSCLC約占肺癌病例的85％是一種預(yù)后惡劣的高發(fā)惡性腫瘤。非小細胞肺癌有兩種最常見的亞型：腺癌(約70％)和鱗狀細胞肺癌(SqCC，約30％)。約三分之二的患者在診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，所以早發(fā)現(xiàn)早治療對于肺癌病人很關(guān)鍵，其中癌癥早期階段診斷死亡率可以降低10—50倍。低劑量螺旋CT(LDCT)是目前非侵入性篩查早期肺癌的重要手段，但常產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因此，肺癌早期檢測需發(fā)展一種微創(chuàng)方法如血漿分子生物標志物。

小分子非編碼RNA(ncRNAs)，尤其是小分子核糖核酸(miRNAs)，它們被發(fā)現(xiàn)在mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。MiRNAs在細胞分化、增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且參與許多類型的疾病包括癌癥,糖尿病,心腦血管和神經(jīng)疾病。不同于miRNAs,ncRNAs在調(diào)節(jié)基因表達的很多層面中發(fā)揮重要作用，如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定及翻譯,ncRNAs包括小snoRNAs，Piwi-相互作用RNAs(piRNAs)，短干擾RNAs(siRNAs)及tRNAs，這些ncRNAs在癌癥和其他疾病中被擾亂。這些發(fā)現(xiàn)為循環(huán)ncRNAs作為不同種類疾病的非侵入性診斷和預(yù)測生物標志物奠定了基礎(chǔ)。

由于靈敏度高,特異性強和模板要求量少，目前大多數(shù)研究使用測量循環(huán)miRNAs逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)方法。因為體液中循環(huán)miRNAs濃度非常低，準確地測量循環(huán)miRNAs的表達是一個巨大挑戰(zhàn)。此外，與基因表達相似，系統(tǒng)因素如原始材料數(shù)量的變化，樣品收集，RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，PCR，這些都會影響最終結(jié)果并且引起偏差和定量誤差。所以當(dāng)前，標準化參考對照分子被用于標準化循環(huán)miRNA PCR數(shù)據(jù)，目的是相對準確評估循環(huán)miRNA的表達，目前參考對照分子包括內(nèi)源和外源性對照。許多研究人員選擇人工合成RNA序列(如秀麗隱桿線蟲miR-39和miR-54,或植物miRNAs)的樣本進行循環(huán)miRNAqPCR標準化分析。然而這些合成miRNAs直接添加到血漿中會被迅速降解，因為它們沒有免受內(nèi)源性核糖核酸酶的保護能力。然而，循環(huán)內(nèi)源性miRNAs是相對穩(wěn)定的，它們綁定到蛋白質(zhì)或包含在核糖體內(nèi)而受保護從而不被內(nèi)源性核糖核酸酶降解。先前的研究已經(jīng)篩選出相對合適的內(nèi)參miRNA(ECM)，如miR-16，但是血清miR-16的水平提高與乳腺癌患者骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外如let-7d/g/i對于循環(huán)miRNA數(shù)據(jù)的標準化是一個很好的內(nèi)源參照，但是卻被發(fā)現(xiàn)let-7d/g/i在某些樣本中不能穩(wěn)定表達。

目前基于比率的方法作為分子標記的研究已經(jīng)在一些疾病中被應(yīng)用，例如，AB42/AB40比率已經(jīng)作為早老性癡呆(AD)的一個分子標記，Apo B/A1比率對于肥胖病人是一個很好的生物化學(xué)指示因子。此外目前miRNA RT-qPCR數(shù)據(jù)使用miRNA比率已經(jīng)在癌癥分子標記研究中被報道。