[發(fā)明專利]一種紙基靈敏檢測miRNA的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710319907.8
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107236790A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉海云;楊浩;何濤
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè))37240
• 代理人: 李茜

1.一種紙基靈敏檢測miRNA的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）制備所需要的試劑

焦炭酸二乙酯處理水成分是1 L 無菌水、1000 μL 焦炭酸二乙酯，經(jīng)搖床過夜、次日高溫高壓滅菌30 min 得到；生長溶液是由667 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的氯金酸、1000 μL 焦炭酸二乙酯處理水、0.0139 g 鹽酸羥胺組成；400 mL 探針DNA緩沖溶液成分是1.0412 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、24.5 g 高氯酸鈉，經(jīng)焦炭酸二乙酯處理水稀釋，濃鹽酸調(diào)節(jié)PH到7得到；

（2）納米金修飾紙芯片

將納米金溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次，將生長溶液滴加至紙芯片的工作區(qū)域，待其自然干燥后，重復(fù)滴加兩次；

（3）巰基和納米金形成金-硫鍵

紙芯片上滴加5 μL 10 nM 用亞甲基藍(lán)標(biāo)簽標(biāo)記巰基修飾的DNA發(fā)夾探針SH-CP-21，在黑暗環(huán)境下室溫放置2 h，然后用20 μL 一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（4）巰基乙醇的表面阻擋

紙芯片上滴加8 μL 巰基己醇自然晾干，最后用20 μL 一倍的磷酸鹽緩沖鹽水洗，自然晾干；

（5）放大和復(fù)用過程

取一定量的50 fM 目標(biāo)分子miRNA-21、特異性雙鏈核酸酶和特異性雙鏈核酸酶緩沖液，使總體積為7 μL，攪拌離心混勻后滴加至紙芯片工作區(qū)域，孵育2 h；

（6）檢測過程

將紙芯片置于適量探針DNA緩沖溶液中，用方波伏安法檢測；方波伏安法檢測的實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：初始電壓為-0.5 V、終止電壓為0.5 V、電位增量為0.004 V、振幅為0.025 V、頻率為25赫茲、靜置時(shí)間為2 S、靈敏度為10^-6 A/V。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，一種紙基靈敏檢測miRNA的方法，其特征在于，反應(yīng)和檢測過程都是在紙芯片上完成的，即采用特異性雙鏈核酸酶在紙芯片上構(gòu)建了miRNA的信號放大機(jī)制，通過電化學(xué)方法在紙芯片檢測。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，一種紙基靈敏檢測miRNA的方法，其特征在于，試驗(yàn)中的目標(biāo)物miRNA-21和DNA發(fā)夾探針SH-CP-21的核苷酸序列，它們的核苷酸序列為說明書核苷酸所述序列。