[發明專利]一種利用兩步酶解法轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法

有效

• 申請號: 201710319796.0
• 申請日: 2017-05-09
• 公開（公告）號: CN107058445B
• 公開（公告）日: 2020-11-20
• 發明（設計）人: 袁其朋;程磊雨
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C07J53/00
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.一種利用兩步酶解法轉化黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法，其特征在于，依次包括以下步驟：

A.酶解緩沖液的配制

準確配制0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液和0.1mol/L的檸檬酸溶液，將兩種溶液按照1.06:1的體積比混合，并用鹽酸調節混合溶液的pH至5.0；

B.第一步酶解

向步驟A中配制好的酶解緩沖體系中加入底物黃芪甲苷，底物中黃芪甲苷的質量百分比為10％，體系中黃芪甲苷的質量濃度為0.1g/L～1g/L；待底物完全溶解后加入水解酶1，水解酶1和黃芪甲苷的質量比為5:1；調節反應體系的pH為4.6～5.2，最后將反應體系置于溫度45～55℃和攪拌轉速為200r/min的條件下充分反應48～72h；

C.第二步酶解

用鹽酸調節步驟B中反應結束后的體系pH至7.0～7.6，再向該體系中加入水解酶2，水解酶2和黃芪甲苷的質量比為50:1，最后將反應體系置于溫度為25～35℃和攪拌轉速為200r/min的條件下充分反應48～72h；

D.環黃芪醇的分離純化

將步驟C中含有產物環黃芪醇的水解液經水飽和正丁醇萃取后真空濃縮蒸干得到萃取產品，并進一步利用硅膠柱層析分離純化，最終再通過乙醇重結晶將產品的純度提高到95％以上，得到環黃芪醇產品；

步驟B中所用的水解酶1為纖維素酶，水解斷裂的是黃芪甲苷C₃位置的β-木糖糖苷鍵；

步驟B中得到酶解產物是6-O-葡萄糖-環黃芪醇；

步驟C中水解酶2為來源于Phycicoccus sp.Soil748的β-葡萄糖苷酶，其基因長度為1848bp，編碼616個氨基酸，具體基因序列為SEQ ID No.1，編碼的蛋白質序列為SEQ IDNo.2，水解斷裂的是中間產物6-O-葡萄糖-環黃芪醇上C₆位置的β-葡萄糖苷鍵；

步驟C中β-葡萄糖苷酶的底物為6-O-葡萄糖-環黃芪醇，步驟C中得到的產物為環黃芪醇。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟C中的β-葡萄糖苷酶通過將β-葡萄糖苷酶基因導入大腸桿菌后誘導表達，再將菌體經超聲破碎后而得到的粗酶液，每100mL的發酵菌液破碎后制得20mLβ-葡萄糖苷酶粗酶液。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟D中的水解液和水飽和正丁醇的體積比為1:0.5，萃取次數為三遍。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟D中的硅膠柱層析填料為100～200目硅膠粉。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟D中硅膠柱層析的洗脫劑為甲醇-氯仿-水的下層溶液，體積比為13:4:2。