[發明專利]HPV檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201710318670.1
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107267663A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 趙海峰
• 申請（專利權）人: 常州金麥格生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙)11370
• 代理人: 黃可峻

發明領域

本發明涉及分子生物學和病毒檢測領域。具體的，本發明涉及人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染的檢測領域。

發明背景

HPV是與子宮頸癌密切相關的病毒。本領域已經發現超過100種 HPV類型。HPV一般感染皮膚(皮膚類型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)。已知超過40種HPV類型會感染子宮頸?；谡T導的良性的、惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分成低危(例如，HPV類型6，11，42，43和44)和高危類型(例如，類型16，18，31，33和45)。高危類型占所有侵入性子宮頸癌的超過99％。因此，HPV類型的檢測和鑒別是非常重要的。高危類型定義為總是發現在高度SIL(鱗狀上皮內的病變)和原位癌中，而低危類型主要發現在低度SIL中。

現在臨床上通常通過細胞形態學的方法測量HPV感染的可能結果，例如采用光學顯微鏡術檢查子宮頸涂片，篩選子宮頸的惡性的和惡化前的病癥。需要研究和發展HPV分子生物學的檢測和分型方法，以便選擇進行監視(隨訪)和治療的患者。

現有的DNA檢測和分型方式很多是通過培養來診斷HPV，存在不少問題。通過檢測HPV抗體進行診斷，也受到不充分的靈敏度和特異性的阻礙。診斷HPV感染的直接方法主要是基于病毒DNA基因組的檢測，其中使用不同形式的DNA/DNA或RNA/DNA雜交，進行或不進行HPV DNA的事先擴增。聚合酶鏈反應(PCR)是能非常有效地擴增微量靶DNA的方法。

本領域已存在不同的鑒別HPV類型的方法。

通過僅識別一種特定類型的PCR引物，可以對HPV DNA進行分型。該方法稱作類型特異性的PCR。已經對HPV類型6，11，16，18，31 和33描述了這樣的方法(Claas等，1989；Cornelissen等，1989； Falcinelli等，1992；Van den Brule等，1990；Young等，1989)。該引物分別是針對類型6，11，16，18，31和33的HPV基因組的E5，L1，E6，L1，E2 和E1區域(Baay等，1996)。

另一種方法是，通用擴增來自所有HPV類型的基因組部分，然后分別與區分致癌組和非致癌組的類型特異性探針的兩種混合物雜交。已經描述了一種類似的分型方法，不需要事先擴增HPV DNA。在雜交體捕獲測定中(Hybrid Capture Sharp Assay；Digene，Silver Springs， MD)，測試每個樣品的″高?！錒PV類型組(例如16，18，31，33，35，39， 45，51，52，56，58，59和68)和另一個″低危″HPV類型組(例如6，11，42， 43和44)(Cox等，1995)。

在CN200910156982中公開了一種HPV檢測及分型方法，其采用特異性引物擴增HPVL1核酸片段；對獲得的HPVL1核酸片段進行焦磷酸測序反應，將焦磷酸測序讀出的序列與HPV型別序列進行比對，判斷HPV分型結果。這種方法雖然特異性好、靈敏度高，但效率比較低，成本也很高。

CN201410154175提供了一種采用等溫擴增和芯片毛細管檢測 HPV型的方法。同時，CN201410154175還提供了一種用于檢測HPV16 型的引物對。該方法基于核酸序列的等溫擴增法結合芯片毛細管技術檢測HPV時，擴增的特異性較高。但同樣存在效率比較低，成本也很高的缺陷。另外，該發明也沒有提供對多種HPV類型進行檢測的方法。

在本領域仍然需要效率更高，假陽性和假陰性更低，并且能同時對多種HPV類型進行檢測和分型的系統。

發明內容

本發明涉及對樣品中的各種類型的HPV核酸進行檢測的方法。具體的，本發明提供了基于熒光定量PCR技術的14種型別HPV病毒的核酸檢測引物和探針，實現了快速和準確檢測HPV病毒型別，用于HPV病毒高危型的檢測，HPV病毒相關性疾病的預測及治療監測。

具體的，本發明提供了(i)分別用以下14種HPV型別的特異性引物對和探針組合中的引物來擴增生物樣品中的核苷酸片段，各型別特異性引物及探針序列如下：

HPV 16型：

上游引物16E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：1，

下游引物16E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：2，

探針16E-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO：3；

HPV18型：

上游引物18E-S1：核苷酸序列如SEQ ID NO：4，

下游引物18E-A1：核苷酸序列如SEQ ID NO：5，