[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)gshB基因提高龍葵毛狀根Cd富集的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710318093.6
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107099547A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 晏瓊;陳友明
• 申請（專利權(quán)）人: 北京交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/68;A01H5/00
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司11257
• 代理人: 趙曉丹

1.一種轉(zhuǎn)gshB基因提高龍葵毛狀根Cd富集的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備龍葵外植體；

(2)制備轉(zhuǎn)gshB基因侵染菌液：將gshB基因與真核表達載體PBI121-gfp連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌A4感受態(tài)細胞；涂平板，挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)入含有卡那抗性的YMA液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)gshB基因侵染菌液；

(3)共培養(yǎng)誘導轉(zhuǎn)gshB基因龍葵毛狀根：將轉(zhuǎn)gshB基因侵染菌液與龍葵外植體進行共培養(yǎng)；

(4)除菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)后的龍葵外植體轉(zhuǎn)移到已濕潤的濾紙上于28℃弱散射光培養(yǎng)2d，隨后轉(zhuǎn)入含有500mg/L的頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基上進行除菌培養(yǎng)，一周后轉(zhuǎn)到不含頭孢噻肟鈉的MS固體培養(yǎng)基上，一個月后龍葵外植體愈傷處會長出的細長毛狀根；

(5)毛狀根液體培養(yǎng)基的擴大培養(yǎng)：將毛狀根轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)；

(6)轉(zhuǎn)gshB基因龍葵毛狀根的檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(2)所述擴增培養(yǎng)是在28℃，150-200rpm搖床中擴增至OD₆₀₀＝0.6。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(6)所述轉(zhuǎn)gshB基因龍葵毛狀根的檢測可以采用分子鑒定和熒光檢測的方法。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述分子鑒定是通過提取毛狀根的DNA，PCR法檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中的rolB基因和PBI121-gshB-gfp融合基因，判斷是否成功獲得轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根；所述熒光檢測是通過綠色熒光蛋白檢測，驗證是否成功獲得轉(zhuǎn)gshB基因毛狀根。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述熒光檢測的熒光顯微鏡的參數(shù)是波長487nm、曝光時間583ms。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(1)所述龍葵外植體是通過取龍葵種子滅菌后接種于MS固體培養(yǎng)基，28℃光照培養(yǎng)，當龍葵無菌苗長出3到4對真葉后，剪取無菌葉片獲得。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟(5)所述擴大培養(yǎng)為28℃，100-110rpm搖床進行培養(yǎng)。