[發明專利]微載體懸浮培養細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法

有效

• 申請號: 201710317050.6
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107198771B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 張毓金;嚴悌昆;黃淑芬;敖艷華
• 申請（專利權）人: 廣州漁躍生物技術有限公司;廣東漁躍生物技術有限公司
• 主分類號: A61K39/245
• 分類號: A61K39/245;A61P31/22;C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種微載體懸浮培養BHK21細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將種子細胞BHK21進行復蘇，然后接種至攪拌式生物反應器中，采用低血清培養基進行微載體懸浮培養，培養條件為：轉速30～50r/min，溶氧40～60％、pH值7.2～7.3、溫度36.5～37.5℃，培養至細胞的濃度為1.5～3×10⁷個/ml；

(2)沉降微載體和細胞，以細胞維持液替換低血清培養基，進行灌流連續培養，培養條件為：轉速60～80r/min，溶氧30～50％、pH值7.4～7.5、溫度35～37℃，灌流速度為1～2個反應器體積/天，同時以同樣的速率泵出細胞懸浮液，保證細胞在反應器中停留時間內擴增至1.5～3×10⁷個/ml；

(3)將豬偽狂犬gE基因缺失病毒按照感染復數為0.01，接種至連續培養的BHK21細胞反應器中進行培養，培養條件為：轉速40～50r/min，溶氧40～50％、pH值7.4～7.5、溫度35.5～36.5℃，接毒12h后開始灌流，灌流速度為1個反應器體積/天，接毒48h后開始收獲病毒液；

(4)將收獲的病毒液進行濃縮、滅活、除菌，即得；

所述的低血清培養基的組成為包含有1～1.5％(m/v)FBS、0.5～2％ (m/v)D-氨基葡萄糖、2～4mmol/L谷氨酰胺、4～6％(m/v)生長促進劑、1.0～1.2％(v/v)雙抗的DMEM培養液；

所述的細胞維持液的組成為包含有4～8mmol/L谷氨酰胺、0.4～1.2mg/L二亞油酰磷脂膽堿、2～6％(m/v)D-氨基葡萄糖、2～4％(m/v)生長促進劑、1.0～1.2％(v/v)雙抗的DMEM培養液；所述的生長促進劑由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.05～0.2的質量比組成；所述活性礦物酵母多肽ACB Bio-Chelate5是礦物元素與酵母多肽形成的絡合物，具體為酵母多肽絡合的鋅、銅、鎂、鐵和硅，購自美國艾緹科技公司；

所述微載體的制備包括以下步驟：

取殼聚糖溶解于2％(v/v)的稀醋酸中，磁力攪拌制成濃度為10～15％(m/v)的殼聚糖溶膠液，加入1～4％(m/v)醋酸銨，攪拌均勻，加入聚羥基脂肪酸酯，超聲處理25～30min，然后密封于高壓蒸汽鍋中，在250℃下處理3～4h，冷卻至室溫，離心取沉淀，用去離子水清洗2～3次，在60℃下真空干燥4～6h，得到表面含有聚羥基脂肪酸酯的殼聚糖微球，將得到的殼聚糖微球浸泡于1％(m/v)戊二醛溶液中，常溫下反應2h，過濾，取沉淀，用去離子水反復清洗多次，真空40℃下干燥24h，即得殼聚糖微載體。

2.根據權利要求1所述的微載體懸浮培養BHK21細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的將種子細胞BHK21進行復蘇具體為：將BHK21細胞種自液氮罐中取出復蘇，加入含10％新生牛血清的DMEM培養基中，在37℃，5％CO₂下培養，直至其長成良好單層，然后用適量含0.02％EDTA胰蛋白酶消化液，37℃消化6～8min，使用含10％新生牛血清的DMEM培養基調整細胞密度為3～5×10⁵個/mL的細胞懸液。

3.根據權利要求1所述的微載體懸浮培養BHK21細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的生長促進劑由硫酸角質素寡聚糖和活性礦物酵母多肽以1:0.15的質量比組成。

4.根據權利要求1所述的微載體懸浮培養BHK21細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的微載體為殼聚糖微載體，所述的微載體濃度為4～6g/L。

5.根據權利要求1所述的微載體懸浮培養BHK21細胞生產豬偽狂犬gE基因缺失病毒疫苗的方法，其特征在于，所述的聚羥基脂肪酸酯的加入量為殼聚糖的30～40％(m/m)。