[發明專利]一種ZmEDS基因及其編碼蛋白、定點突變基因及應用

有效

• 申請號: 201710316202.0
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107119034B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 王強;梁瑾;諶琴琴
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12P7/22
• 代理公司: 成都天匯致遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51264
• 代理人: 韓曉銀

1.一種ZmEDS基因的定點突變基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的編碼蛋白，其特征在于，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO:3-6所示。

2.一種如權利要求1所述的ZmEDS基因的定點突變基因ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS-V306A和ZmEDS-I279G的編碼蛋白在倍半萜生物合成上的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

1）將SEQ ID NO:1所示的基因克隆到原核表達載體pET-28a（+）中，插入限制性內切酶NdeI和EcoRI位點間，得到重組質粒pET28a/ZmEDS；

2）對pET28a/ZmEDS的第303位、411位、306位和279位四個氨基酸位點進行定點突變，分別制備得到含ZmEDS-F303A、ZmEDS-G411C、ZmEDS- V306A、ZmEDS-I279G四個定點突變基因的原核表達質粒；分別是在ZmEDS蛋白序列上的第303位苯丙氨酸突變為丙氨酸、第411位甘氨酸突變為半胱氨酸、第306位纈氨酸突變為丙氨酸和第279位異亮氨酸突變為甘氨酸，并且其余核苷酸序列與ZmEDS的核苷酸序列無異，其蛋白序列分別如SEQ ID NO:3-6所示；

3）將pMEVT/MBIS分別與pET28a/ZmEDS、ZmEDS-F303A、ZmEDS- G411C、ZmEDS-V306A、ZmEDS-I279G同時加入25 μL大腸桿菌BL21感受態細胞中，其中，重組質粒各100-150ng，冰浴20 min，42℃熱激1 min20 s，冰上冷卻2 min后加入液體LB培養基200 μL，37℃ 200 rpm下復蘇1.5 h，再涂布于含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的固體LB培養基平板上；37℃倒置過夜培養，第二天劃線取平均菌落，置于同時含有氯霉素50 mg/L和硫酸卡那霉素50 mg/L的5 mL液體LB培養基中，37℃ 200 rpm過夜培養；制備得到上述五種菌種，菌種為大腸桿菌BL21背景株系，且每個菌種分別含有兩種質粒：

①pMEVT/MBIS，pET28a/ZmEDS；

②pMEVT/MBIS，ZmEDS-F303A；

③pMEVT/MBIS，ZmEDS-G411C；

④pMEVT/MBIS，ZmEDS-V306A；

⑤pMEVT/MBIS，ZmEDS-I279G；

次日取2 mL上述菌種置于50 mL NZY液體培養基，培養基中加入相應的抗生素，37°C200 rpm培養，菌液培養至A₆₀₀達到0.8-1.0，向其中加入1 M的IPTG終濃度至1 mM，然后將菌液轉至16 °C，200 rpm誘導培養24 h；之后用等體積的正己烷萃取萜類產物，16°C 200 rpm萃取30 min；振蕩充分后，取出靜置，取上層有機相使用旋轉蒸發儀濃縮至1 mL，轉移至GC樣品瓶中，用于GC-MS檢測，制備得到倍半萜類化合物。