[發明專利]一種鎘污染底泥的微生物修復方法

有效

• 申請號: 201710315620.8
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107138521B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 范文宏;彭位華
• 申請（專利權）人: 北京航空航天大學
• 主分類號: B09C1/10
• 分類號: B09C1/10
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳小燦;朱亞娜

1.一種鎘污染底泥的微生物修復方法，其特征在于，包括以下兩個步驟，

步驟一：針對鎘污染底泥的硫酸鹽還原菌的富集、馴化與擴大培養；

（1）培養基：KH₂PO₄ 0.5 g/L，NH₄Cl 1 g/L，CaSO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1 g/L，抗壞血酸0.1 g/L，巰基醋酸0.1 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5 g/L，超純水1 L，調節pH在7.0~7.5之間；

（2）菌種富集：挑取2 g水庫天然底泥樣品，放入50 mL具塞玻璃管中，加入9 mL的0.75%的生理鹽水，得到10^-1的稀釋液；搖勻后，吸取2 mL的底泥稀釋液加入到滅菌后的含有300mL培養基的錐形瓶中；用封口膜密封錐形瓶，將其放入30℃恒溫培養箱中培養；2~3天后，富集到SRB菌液；

（3）菌種馴化：吸取15 mL富集得到的SRB菌液加入到另一個300 mL的培養基中，進行下一次純化培養，如此重復操作三次純化培養；

（4）菌種擴大培養：按上述（1）中的培養基配方稱取各組分后，使用超純水定容到1 L，輕搖，待藥品充分溶解后，轉移到300 mL錐形瓶中，用鋁箔紙封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌后備用，滅菌條件為121℃，20 min；其中，巰基醋酸和抗壞血酸需要單獨配制成質量百分比含量為10%的溶液，進行高壓蒸汽滅菌；每300 mL培養基中加入15 mL馴化后的SRB菌液進行擴大培養，待出現黑色后即可用于底泥修復；

步驟二：硫酸鹽還原菌修復Cd污染底泥；

在室溫條件下，先將濕重為800 g的底泥裝入2000 mL燒杯中；加入超純水定容至1800mL；然后加入步驟一中擴大培養的菌液300 mL；勻速攪拌使培養基與底泥充分混合；燒杯經保鮮膜密封后，放置在30℃的生化培養箱中，進行為期166天的修復；利用修復前后底泥間隙水的鎘含量并利用改進的Tessier連續提取法對修復前后的底泥進行Cd化學形態分析來評價修復效果，可知，底泥孔隙水Cd含量明顯降低，底泥中非穩定態Cd含量明顯減少，而相對穩定態Cd含量增加；所述的SRB菌液為復合菌，在科水平上，所述復合菌包括紫單胞菌科、毛螺菌科、梭菌科1、脫硫弧菌科、芽胞桿菌科、疣微菌科、梭菌目XI科、擬桿菌科、克里斯滕森菌科；其中，脫硫弧菌在脫硫弧菌目、脫疏弧菌科和脫硫弧菌屬水平上的細菌豐度為8.28%。

2.根據權利要求1所述的一種鎘污染底泥的微生物修復方法，其特征在于，在步驟二中，利用修復前后底泥間隙水的鎘含量并利用改進的Tessier連續提取法對修復前后的底泥進行Cd化學形態分析來評價修復效果，可知，底泥孔隙水Cd含量明顯降低，底泥中可交換態Cd含量明顯減少，而鐵錳氧化物結合態和有機物結合態Cd含量增加。

3.根據權利要求1或2所述的一種鎘污染底泥的微生物修復方法，其特征在于，所述改進的Tessier連續提取法，具體操作步驟如下：

①可交換態：稱取1.000 g底泥至50 mL離心管中，加入1 mol/L的MgCl₂溶液8 mL，在25±1℃下振蕩提取1 h后，離心，用5 mL移液槍取4 mL上清液；向提取液中加入1 mL 70%的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止，待溫度降到70℃時再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待測；用16 mL超純水洗滌殘余物，離心，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取；

②碳酸鹽結合態：將步驟①提取后的冷凍殘渣，加入1 mol/L的NaOAc溶液8 mL，在25±1℃條件下振蕩提取5 h后，離心，用5 mL移液槍取1 mL上清液；向提取液中加入1 mL70%的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止，待溫度降到70℃左右時再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待測；用16 mL超純水洗滌殘余物，離心，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取；

③鐵錳氧化物結合態：在步驟②提取后的冷凍殘渣中，加入20 mL 0.04 mol/L的NH₂OH?HCl的25%HAc溶液，在96±3℃條件下振蕩提取6 h，冷卻離心，用5 mL移液槍取15 mL上清液；向提取液中加入1 mL70%的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止，待溫度降到70℃左右時再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待測；用16 mL超純水洗滌殘余物，離心，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取；

④有機物結合態：在步驟③提取后的冷凍殘渣中，加入3mL 0.02mol/L的 HNO₃的溶液，再加入5mL 30%的 H₂O₂，85±2℃條件下振蕩提取2 h后，加入3 mL 30%的H₂O₂，在85±2℃條件下再振蕩提取3 h，冷卻至25±1℃，加入5 mL 3.2 mol/L的NH₄OAc的20% HNO₃溶液，并用超純水稀釋到20 mL后再振蕩提取30 min，再次離心，取15 mL上清液；向提取液中加入1mL70%的濃硝酸，搖勻，之后將消解管放到自制消解爐上以140℃加熱至完全干燥為止，待溫度降到70℃左右時再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待測；用16 mL超純水洗滌殘余物，離心，棄去上清液，重復操作洗滌三次，洗滌后的殘渣經-18℃冷凍后用于下一步提取；

⑤殘渣態：將步驟④提取后的冷凍殘渣轉移至消解管中，依次加入65%~68%的HNO₃ 1mL和70%~72% HClO₄ 4 mL，加完之后按照以下的加熱程序方式進行：50℃加熱3 h，70℃加熱0.5 h，100℃加熱0.5 h，150℃加熱3 h，190℃加熱至完全干燥；待溫度降到70℃左右時再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，離心，取上清液待測。