[發明專利]利用GST表達體系制備抗人PIAS3高效價抗體及應用

在審

• 申請號: 201710315449.0
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN106916223A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 李曉萌;姜春娃;趙兵;楊柳;程秀;邱敏敏;李江
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K16/06;C07K19/00;C12N15/12;C12N15/70
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1.利用GST表達體系制備的抗人PIAS3 Exon2 35aa高效價抗體，其特征在于利用GST表達體系以人PIAS3 87-121位氨基酸對應DNA片段作為特異序列，制備的GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白作為抗原免疫新西蘭家兔產生抗血清而獲得，該抗血清中抗GST-PIAS3 Exon2 35aa抗體的滴度高達1∶1000000，并經過Western blot鑒定該抗PIAS3 Exon2 35aa抗體具有較好的特異性，其中，87-121位氨基酸序列為：

其對應核苷酸序列為：

1 gtaggctccc ctggtcctct agctcccatt cccccaacgc tgttggcccc tggcaccctg

61 ctgggcccca agcgtgaggt ggacatgcac ccccctctgc cccag。

2.如權利要求1所述的原核表達GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于利用GST表達系統獲得GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白，再經免疫新西蘭家兔獲得抗GST-PIAS3 Exon2 35aa抗血清，具體包括五步：

第一步，PCR-pMD18-T/PIAS3 Exon2 35aa重組質粒的構建

PIAS3mRNA序列從Genebank得到，基因序列號為NM_006099。以cDNA為模板，上游引物：5’-GAATTCGTAGGCTCCCCTGGTCCTCTAGCTCCCATTCCCCCAACGCTGTTGGCCCCTGGCACCCTGC(含EcoRI酶切位點)；下游：5’-CTCGAGTCACTGGGGCAGAGGGGG(含XhoI酶切位點)，擴增得到的片段與pMD18-T載體連接，將連接產物轉入感受態大腸桿菌DH5α中，在含Amp⁺瓊脂平板上挑選克隆,以堿裂解法小提重組質粒后，以EcoRI和SalI單酶切鑒定；

第二步，原核表達載體pGEX-4T-1的構建

將含有PIAS3基因2號外顯子87-121氨基酸對用的cDNA片段的pMD18-T質粒經EcoRI和XhoI雙酶切后，利用回收試劑盒獲得PIAS3基因該區片段，同時用相同的酶處理質粒pGEX-4T-1，然后將回收的PIAS3基因2號外顯子87-121氨基酸對應的核苷酸片段和經酶切的載體pGEX-4T-1在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜，酶切鑒定重組體，并且測序進一步確定；

第三步，GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的誘導表達和純化

重組質粒PGEX-4T-1/PIAS3 Exon2 35aa轉化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Amp⁺培養基中，37℃振搖培養過夜。次日，將培養物按1∶50的比例轉接于含Amp⁺的LB培養基中，繼續在37℃搖床培養至對數生長中期。在培養液的A600為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.08mmol/L，不加入IPTG者為陰性對照，置25℃繼續培養4～5h。離心收集菌體，以SDS-PAGE進行鑒定GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白的表達，并優化表達條件，進行大量擴增誘導。以5000r/min于4℃離心5min，收集菌體,用60mL冰預冷的NETN懸浮1L菌液的沉淀。用超聲裂解細菌,再以9600rpm，于4℃離心15min，取上清，過Glutathione-Sepharose 4B柱，先以等體積洗脫緩沖液1(含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl，pH＝8.0)洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2(含100mM谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液,SDS-PAGE鑒定純化產物；

第四步，兔抗PIAS3 Exon2 35aa抗血清的制備及純化

以純化的PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用300μg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點注射，免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照，2周后進行第1次加強免疫，300μg純化的PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射，之后每隔2周加強免疫1次，于末次免疫后1周后取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當抗體效價達到1∶1000000時，頸動脈放血，收集血清，將ProteinA/G sepharose CL-4B填料緩慢裝柱，平衡柱子后加入經過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結合，即親和層析使抗體結合在柱子上，經2次洗滌后，加pH2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色鑒定；

第五步，PIAS3 Exon2 35aa抗體的免疫學檢測

用GST-PIAS3 Exon2 35aa融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照，將純化后的GST-PIAS3 Exon2 35aa抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后采用間接ELISA方法測定抗體的效價，并采用Western blot方法分析PIAS3 Exon2 35aa抗體特異性，將純化的融合蛋白GST-PIAS3 Exon2 35aa樣品，經SDS-PAGE分離后再電轉移至硝酸纖維素膜上，以5％脫脂奶粉封閉1h，依次滴加兔抗PIAS3 Exon2 35aa抗體，室溫2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應1h、PBS洗滌3次，最后加底物DAB顯色，并拍照。