[發明專利]用于指導阿司匹林個體化用藥相關基因檢測的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710315144.X
• 申請日: 2017-05-08
• 公開（公告）號: CN107142307A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 韓林志;肖芳;李書
• 申請（專利權）人: 韓林志
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及體外診斷技術領域，特別的，涉及一種用于指導阿司匹林個體化用藥相關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及方法。

背景技術

阿司匹林作為一種有效的抗血小板聚集藥，可抑制血小板活化、聚集，防止血栓形成，在心腦血管病的一、二級防治中，起著至關重要的作用。然而，臨床發現部分長期服用阿司匹林的患者，心腦血管事件的發生率并未降低，即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(Aspirin resistance，AR)現象。有研究報道5％-40％的人存在阿司匹林抵抗。

阿司匹林(aspirin)可與COX活性部分絲氨酸殘基發生不可逆的乙酰化反應，使COX失活，抑制血小板功能。COX-1啟動子區的SNPCOX1(-1676A>G)位點多態性會影響COX-1的表達，使阿司匹林可能對血小板COX不能完全抑制，從而存在一定程度的阿司匹林抵抗。在一項對老年心腦血管病患者發生阿司匹林抵抗的研究中，研究者首次發現COX-1基因-1676A>G位點(rs1330344)的多態性可能與中國漢族人群AR的發病相關。

血小板表面主要有GP Ⅰa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ三種膠原受體。GP Ⅰa/Ⅱa位于連接血小板與膠原纖維(Ⅰ、Ⅱ型)或非膠原纖維(Ⅲ、Ⅳ型)的二價陽離子鍵之間。GPIa基因位于第5號染色體上，它的SNP常常會改變血小板膜膠原受體的密度，使血小板的聚集、血栓形成發生改變，影響阿司匹林的療效。807C>T和873G>A已被證實與血小板表面受體不同的表達有關。基因型807TT(873AA)與受體的高密度表達有關，而807CC(873GG)則與低密度表達有關，雜合子則與中間受體表達的水平有關。Santoso等研究發現攜帶rs1126643T等位基因，血小板表面的GP Ⅰa/Ⅱa的密度增加4倍，血小板活性顯著增加，血小板聚集加強。蘇冠華等對200例服用阿司匹林進行心腦血管病預防的中國漢族高危人群進行分析，結果顯示AR和ASR組T等位基因頻率均顯著高于AS組(χ2＝12.848，P<0.005)；AR組與ASR組的TC和TT基因型頻率也均高于AS組(P<0.05)。Logistic回歸分析提示，血小板膜蛋白rs1126643T等位基因與AR的發生顯著相關(OR3.76，95％CI：2.87～9.58，P<0.05)。

因此臨床上在對病人進行藥物治療時需首先對與阿司匹林個體化用藥相關的基因位點基因進行檢測，再判斷是否服用阿司匹林進行進行治療，使治療更加具體而精準，也可避免延誤患者的治療，減少資源浪費。

目前常用的檢測基因多態性的方法有DNA直接測序法、限制性片段長度多態性分析法(PCR－PFLP)、高分辨率溶解曲線(HRM)、基因芯片、液相芯片法、熒光定量PCR法等。測序技術是公認的檢測基因突變的金標準，但其設備成本高、檢測周期長、檢測通量低、檢測靈敏度低、對實驗人員的技術操作要求高、結果判定步驟繁瑣等原因，較難形成商業化的診斷產品；限制性片段長度多態性分析法檢測靈敏度同樣不高、操作步驟繁瑣，檢測的結果仍需要進行一代測序法的再次驗證，尤其當樣本量多時極易造成PCR產物的交叉污染容易出現酶切不充分或酶切過度而出現假陰性或假陽性結果，因此也無法應用到臨床上。芯片檢測因其檢測結果的準確性和重復性較差，實驗周期長等缺點，也不適于開發臨床檢測試劑盒。熒光定量PCR的檢測方法擁有成本低、靈敏度高、特異性好，結果的重復性好等優點。

發明內容

為了解決存在阿司匹林抵抗的患者不建議采用阿司匹林藥物進行心腦血管病治療的技術問題，本發明從基因層面出發，提供一種指導阿司匹林個體化用藥關基因多態性檢測的引物組、試劑盒及其方法，具有檢測快速、準確性高、靈敏度高及特異性好的優點。

本發明提供一種用于指導阿司匹林個體化用藥相關基因檢測的引物組，其特征在于，包括針對GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(-1676A>G)基因多態性檢測的特異性引物及探針，如下：

GPIa(807C>T)正向引物：

5’-CAACATCCCAGACATCCCAAT-3’；

GPIa(807C>T)反向引物：

5’-CCTATTAGCACCAAAACTTACCTTGC-3’；

GPIa(873G>A)正向引物：

5’-CATGTGATTCACCGTCAGTTACAA-3’；

GPIa(873G>A)反向引物：