[發(fā)明專利]一種異源表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710314231.3
• 申請(qǐng)日: 2017-05-06
• 公開（公告）號(hào): CN107119066B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王巖;張曉華;李慧;杜良成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12N1/21;C12N15/55;C12R1/01
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

本發(fā)明的目的是提供一種在產(chǎn)酶溶桿菌中異源表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶的方法。本發(fā)明通過啟動(dòng)子的選擇優(yōu)化，利用高效恒定表達(dá)啟動(dòng)子P_groEL，實(shí)現(xiàn)了來自于海洋細(xì)菌耐油具柄菌的群體感應(yīng)淬滅酶基因momL在陸生菌產(chǎn)酶溶桿菌中的異源表達(dá)，使構(gòu)建的工程菌株具有抗菌及群體感應(yīng)淬滅酶雙重活性。并且，本發(fā)明將產(chǎn)酶溶桿菌的黃色素合成基因簇中的酮還原酶基因作為重組載體的整合位點(diǎn)，通過同源重組導(dǎo)致黃色素基因插入失活，而使菌落呈乳白色的方法，來篩選目標(biāo)重組菌株，篩選效率大大提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于有益微生物構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在產(chǎn)酶溶桿菌中異源表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶的方法。

背景技術(shù)

產(chǎn)酶溶桿菌廣泛生存于土壤和水環(huán)境中，能夠分泌一系列胞外酶及具有抗植物真菌病原菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是溶桿菌屬中最具有生物防治潛力的一種革蘭氏陰性菌。近年來，產(chǎn)酶溶桿菌作為一種新的生物防治劑被普遍用于防治由真菌引起的農(nóng)作物病害，如產(chǎn)酶溶桿菌OH11對(duì)立枯絲核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，并且對(duì)番茄青枯病也具有很好的防治作用，其防治效果達(dá)86.4％(Borasr et al.1993)；產(chǎn)酶溶桿菌3.1T8對(duì)坪草腐霉枯萎病菌具有拮抗作用，其產(chǎn)生的脂肪酶對(duì)腐霉根冠腐病存在抑制作用(Brederode et al.1991)，此外，3.1T8也能夠?qū)α⒖萁z核菌、瓜果腐酶、辣椒疫霉菌、番茄枯萎菌、番茄葉霉菌、黃瓜褐斑病菌進(jìn)行抑制(Folman et al.2003)；產(chǎn)酶溶桿菌N4-7對(duì)由夏季斑枯病菌引起的草坪夏季斑枯病具有較好的生物防治作用(Kobayashi et al.1996)；產(chǎn)酶溶桿菌C3可以用于防治由單孢銹菌引起的大豆銹病，平臍蠕孢菌引起的高羊茅葉斑并，并且它還可以通過幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶及HSAF等物質(zhì)的抗真菌活性對(duì)小麥根腐病菌引起的離蠕孢葉枯病進(jìn)行有效的防治(Zhang et al.1999，Zhang et al.2001，Palumbo et al.2005，Li et al.2008)。然而，上述實(shí)例均為產(chǎn)酶溶桿菌用于對(duì)植物病原真菌的抑制效果，而對(duì)植物細(xì)菌性病害的控制報(bào)道較少。為擴(kuò)大產(chǎn)酶溶桿菌對(duì)植物致病菌的防治范圍，可以構(gòu)建具有新特性的產(chǎn)酶溶桿菌工程菌株用于植物細(xì)菌性病害的防治，MomL，一種群體感應(yīng)淬滅酶，屬于金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族，與最相似蛋白為來自Bacillussp.240B1的AiiA，其同源性僅為24.5％，MomL具有明顯的抑制病原菌致病因子及防病害能力，可作為生防蛋白進(jìn)行改造利用。若將MomL在產(chǎn)酶溶桿菌中異源表達(dá)，則將賦予該菌更廣譜的抑菌殺菌能力，但是產(chǎn)酶溶桿菌對(duì)多種抗性篩選使用的抗生素具有天然的抗性，增加了其遺傳操作過程中轉(zhuǎn)化子的篩選難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種在產(chǎn)酶溶桿菌中異源表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶MomL的方法，即借助所構(gòu)建的帶有特異性啟動(dòng)子的表達(dá)載體使群體感應(yīng)淬滅酶MomL能夠在產(chǎn)酶溶桿菌中穩(wěn)定高效的表達(dá)；并且通過菌落黃-白顏色變化作為轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記，使其異源表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶MomL，賦予產(chǎn)酶溶桿菌一種新的生防特性，利用構(gòu)建的重組菌株產(chǎn)酶溶桿菌LeMomL對(duì)植物細(xì)菌性軟腐病致病菌進(jìn)行抑制，并應(yīng)用于植物細(xì)菌性軟腐病防治。

本發(fā)明首提供一種用于在產(chǎn)酶溶桿菌中表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶MomL的表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體，其中使用的啟動(dòng)子的核苷酸序列為SEQ ID NO:1；

作為優(yōu)選，所述的重組表達(dá)載體，是將外源基因整合到產(chǎn)酶溶桿菌的黃色素合成基因簇中；

作為實(shí)施例的優(yōu)選，是將外源基因整合到黃色素基因簇酮還原酶合成基因內(nèi)部；

本發(fā)明另一個(gè)方面提供重組產(chǎn)酶溶桿菌，是用于重組表達(dá)群體感應(yīng)淬滅酶MomL；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種篩選重組產(chǎn)酶溶桿菌的方法，是通過顏色變化作為篩選標(biāo)記來篩選工程菌株；

本發(fā)明提供的重組產(chǎn)酶溶桿菌菌株作為生物防治菌株的應(yīng)用。