[發(fā)明專利]一種融合蛋白及光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710312736.6
• 申請(qǐng)日: 2017-05-05
• 公開（公告）號(hào): CN107141354A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李斯文;趙磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李斯文;趙磊
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;A61K41/00;A61K47/64;A61K47/69;A61P35/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所11569
• 代理人: 王加貴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于光動(dòng)力治療技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種融合蛋白及光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

白血病干細(xì)胞是患者體內(nèi)存在的一種比例極少的腫瘤細(xì)胞，是白血病發(fā)生、發(fā)展和耐藥的根源。人IL-3受體是由α和β亞基組成的異源二聚體，IL-3受體α亞基(IL-3Rα、CD123)具有在急性髓性白血病(AML)干細(xì)胞中較高的表達(dá)量，而在正常造血干細(xì)胞表面不表達(dá)的特點(diǎn)，使其成為AML靶向治療的重要靶點(diǎn)。

已有研究利用IL-3在正常造血干細(xì)胞上不表達(dá)，而在AML干細(xì)胞中高表達(dá)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)以IL-3為靶頭的偶聯(lián)藥物，并在體內(nèi)外體現(xiàn)出有很好的靶向性和治療效果。有研究已經(jīng)報(bào)道IL-3和化療藥物達(dá)托霉素偶聯(lián)形成的融合蛋白有更好的靶向性殺傷作用，明顯降低了達(dá)托霉素單獨(dú)使用時(shí)的毒副作用。但該融合蛋白基于化療藥物，系統(tǒng)毒性大。目前并沒有一種毒性更小的IL-3偶聯(lián)藥物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白及光敏劑復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，為了提供一種水溶性好、粒徑均一性好，且對(duì)IL-3Rα腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向性高的光敏劑復(fù)合物，在體內(nèi)外都顯示出增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，以及良好的生物相容性和安全性。

本發(fā)明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-3和HSA，所述IL-3和HSA通過五肽進(jìn)行偶聯(lián)。

優(yōu)選的是，所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:11所示。

本發(fā)明還提供了編碼上述技術(shù)方案所述融合蛋白的基因，所述基因序列如SEQ ID NO:4所示。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述融合蛋白的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體為融合有上述技術(shù)方案所述基因的pcDNA3.0載體。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，為哺乳動(dòng)物真核表達(dá)系統(tǒng)。

優(yōu)選的是，所述哺乳動(dòng)物真核表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞為HEK293細(xì)胞。

本發(fā)明還提供了一種光敏劑復(fù)合物，所述光敏劑復(fù)合物為Ce6以非共價(jià)鍵結(jié)合到上述技術(shù)方案所述融合蛋白的HSA部分得到。

優(yōu)選的是，所述光敏劑復(fù)合物的平均水化粒徑為8.5nm。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

在避光條件下，將上述技術(shù)方案所述融合蛋白與Ce6溶液按照融合蛋白與Ce6摩爾比為1：5混合，在旋轉(zhuǎn)條件下反應(yīng)14h，得到光敏復(fù)合物。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述光敏劑復(fù)合物或上述技術(shù)方案所述制備方法得到的光敏劑復(fù)合物在制備靶向治療急性髓性白血病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種融合蛋白、光敏劑復(fù)合物及所述光敏劑復(fù)合物的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的光敏劑復(fù)合物包括由IL-3的C端和HSA的N端通過五肽連接而成的融合蛋白和以非共價(jià)鍵形式連接在所述融合蛋白的HSA部分的Ce6。本發(fā)明的光敏劑復(fù)合物水溶性好、粒徑均一性好，對(duì)IL-3Rα腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)靶向性更高，在體內(nèi)外都顯示出增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞殺傷能力，以及良好的生物安全性，所述光敏劑復(fù)合物在制備治療急性髓性白血病藥物中顯示出很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的核酸電泳圖：a：以人PBMC提取的mRNA為模版，得到的PCR產(chǎn)物，M：Marker，Lane1：IL-3，Lane2：HSA；Lane3：His-IL-3-PA；b：重組載體pcDNA3.0-His-IL-3-PA的構(gòu)建，M：Marker，Lane1：pMD-18T-His-IL-3-PA的HindIII和BamHI雙酶切，Lane2：pcDNA3.0的HindIII和BamHI雙酶切；Lane3：His-IL-3-PA和pcDNA3.0的酶連產(chǎn)物；c：重組載體pcDNA3.0-His-IL-3-PA-HSA的構(gòu)建，M：Marker，Lane1：pMD-18T-HSA的BamHI和NotI雙酶切，Lane2：pcDNA3.0-His-IL-3-PA的BamHI和NotI雙酶切；Lane3：HSA和pcDNA3.0-His-IL-3-PA的酶連產(chǎn)物；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的表達(dá)載體pcDNA3.0-His-IL-3-PA-HSA的構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2提供的WB驗(yàn)證融合蛋白的正確表達(dá)：

a、b、c分別是用抗His、抗人IL-3、抗HSA抗體檢測(cè)，其中Lane1為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0的HEK293上清；Lane2為轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA3.0-His-IL-3-PA-HSA的HEK293上清；