[發明專利]一種血管化組織工程骨及其制備方法

有效

• 申請號: 201710308986.2
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107137763B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 張華林;周悅麗;余娜
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: A61L27/18
• 分類號: A61L27/18;A61L27/12;A61L27/40;A61L27/28;A61L27/56;A61L27/50
• 代理公司: 廣州市一新專利商標事務所有限公司 44220
• 代理人: 張芳

1.一種血管化組織工程骨，其特征在于其是由多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石構成的支架以及依次包裹在所述支架表面的成血管內皮細胞膜片和成骨細胞膜片構成，其中用于制備所述成血管內皮細胞膜片的內皮細胞和用于制備成骨細胞膜片的成骨細胞均來源于脂肪間充質干細胞，具體工藝過程為：

1）多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石的制備

將珊瑚羥基磷灰石用質量濃度為0.25%～1.25%的多聚賴氨酸溶液在0～4℃溫度條件下浸泡15～24h，之后負壓抽濾，置-20℃冰箱冷凍過夜，冷凍干燥即可；

2）成骨細胞膜片的制備

將第三代或第四代脂肪間充質干細胞先用胰蛋白酶消化，然后用DMEM/F12培養基終止消化，按1×10⁶～3×10⁶ 個/cm²的密度接種至培養皿中，加入含10～12%胎牛血清和1～1.5%雙抗的DMEM/F12培養基上，置于37℃，5％ CO₂恒溫培養箱中培養24～48h，然后再用成骨細胞誘導培養液培養10～14天即可；

3）成血管內皮細胞膜片的制備

取第三代或第四代脂肪間充質干細胞按2×10⁶～4×10⁶ 個/cm²的密度接種于含10～12%胎牛血清和1～1.5%雙抗的DMEM/F12培養基中培養24～48h，然后再用血管內皮細胞誘導液持續培養10～14天即可；

4）血管化組織工程骨的構建

將過程3）所得的成血管內皮細胞膜片纏繞在過程1）所得的多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架表面，包裹一圈，然后將過程2）所得的成骨細胞膜片包繞在上述成血管內皮細胞膜片外面，包繞一圈，形成卷層樣復合體，以絲線纏繞固定。

2.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程1）中，每3小時震蕩搖勻浸泡液。

3.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程1）中，所述負壓抽濾至未見任何氣泡自珊瑚羥基磷灰石表面孔隙溢出即可。

4.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程1）中，所述冷凍干燥是指：將冷凍過夜后的以多聚賴氨酸溶液浸泡的珊瑚羥基磷灰石放入冷凍干燥機內，在溫度-42℃～-47℃、負壓20-28Pa條件下，預冷30min后開始抽真空，控制真空度25～28Pa，冷凍干燥48～72h。

5.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程2）中，所述成骨細胞誘導培養液組成為：DMEM/F12培養基170～180ml，胎牛血清 17～22ml，雙抗1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗壞血酸550～580ul，β-甘油磷酸鈉 2～3ml，地塞米松15～25ul。

6.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程2）中，用誘導培養液培養時，隔日換液培養。

7.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程3）中，所述血管內皮細胞誘導液組成為：內皮細胞生長培養基90～110ml，胎牛血清 4.5～5.5ml, 維生素C 0.09～0.11ml, 慶大霉素-兩性霉素B 0.09～0.11ml, 氫化可的松0.036～0.044ml, 人表皮生長因子0.09～0.11ml, 人成纖維細胞生長因子0.45～0.55ml, 類胰島素一號增長因子0.09～0.11ml,血管內皮細胞生長因子0.09～0.11ml。

8.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程3）中，用血管內皮細胞誘導液培養過程中，隔2-3天換液培養。

9.按照權利要求1所述的血管化組織工程骨，其特征在于過程4）中，所述多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架在使用前用含10～12%胎牛血清和1～1.5%雙抗的DMEM/F12培養基浸泡12～24h。