[發明專利]基于核酸適配體特異性檢測磺胺嘧啶的生物傳感探針試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710308740.5
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107119054B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 樂濤;孫琦;張磊;張志浩
• 申請（專利權）人: 重慶師范大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/535
• 代理公司: 重慶輝騰律師事務所 50215
• 代理人: 王海軍

1.一種生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體，其特征在于：所述生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體的核苷酸序列為序列表記載的SEQ ID No.1。

2.根據權利要求1所述的生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體，其特征在于：所述生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體由單鏈DNA組成，且3'末端或5'末端標標記有生物素。

3.根據權利要求1所述的生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體，其特征在于：所述生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體的制備方法包括如下步驟：

1)將磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶分別和羧基瓊脂糖磁珠偶聯；分別將磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶經活化氨基后，取羧基瓊脂糖磁珠與活化的磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶溶液混合，進行偶聯反應；分別獲得磺胺嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠偶聯物、磺胺間甲氧嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠偶聯物；

2)單鏈DNA文庫與相應引物準備：隨機文庫為全長96bp的單鏈DNA文庫的核苷酸序列為SEQ ID No.2，其中，N60為60個堿基的隨機序列；上游引物的核苷酸序列為SEQ ID No.3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID No.4；

3)SELEX篩選磺胺嘧啶核酸適體；

4)克隆測序獲得生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體。

4.根據權利要求3所述的生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體，其特征在于：所述SELEX篩選磺胺嘧啶核酸適體的步驟為：

1)文庫變性：將溶解的上述ssDNA文庫置于95℃水浴中放置10-20min；

2)反篩：取磺胺間甲氧嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠偶聯物，與變性的文庫混合，室溫孵育，反應完畢，離心，保留上層清液，得到反篩未結合文庫；并且第一輪不做反篩；

3)正篩：取磺胺嘧啶修飾的瓊脂糖磁珠偶聯物加入上一步驟得到的反篩未結合文庫，在室溫孵育，反應完畢，離心并棄去上層清液，得到正篩未結合文庫；

4)洗提結合DNA：將上一步驟得到的正篩未結合文庫用NaOH洗提6次；

5)純化洗提的DNA：用NAP-5寡核苷酸純化柱子對NaOH洗提液進行回收純化，以去除NaOH及其他雜質，得到的篩選產物DNA溶液即為篩選一輪的適體，一輪篩選完畢；

6)以篩選適體DNA為模板，通過對稱PCR、鏈酶親和素瓊脂糖珠等技術獲得大量的DNA，為下一輪篩選做準備；

7)重復上述步驟1-6，共篩選7輪。

5.一種基于核酸適配體特異性檢測磺胺嘧啶的生物傳感探針試劑盒，其特征在于：包括權利要求1-4任一項所述的生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體的稀釋液和辣根過氧化物酶標記磺胺嘧啶親和素稀釋液。

6.權利要求5所述基于核酸適配體特異性檢測磺胺嘧啶的生物傳感探針試劑盒的使用方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)取鏈霉親和素溶解于PBS中，37℃放置1小時；加入戊二酸溶液，混勻；4℃放置2小時，將反應液全量加至處理好的透析袋中，透析；將透析好的鏈霉親和素戊二酸復合物用包被緩沖液液稀釋1mg/mL,取稀釋好的鏈霉親和素戊二酸復合物加至酶標板，每孔200μL，混勻，37℃包被過夜；包被酶標板洗滌4次后備用；

2)將預處理25μL生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體探針、25μL磺胺嘧啶-辣根過氧化物酶、50μL不同濃度磺胺嘧啶標準品混合均勻，37℃孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標板的凹槽；37℃孵化45min后，棄去反應液，洗滌3次，拍干后每孔再加入顯色劑A1和A2各100mL避光顯色30min，反應后，用酶標儀測溶液吸光度，繪制濃度-吸光度標準曲線；

3)測試待檢樣品過程，重復上述步驟2)：將預處理25μL生物素標記磺胺嘧啶核苷酸適配體探針、25μL磺胺嘧啶-辣根過氧化物酶、50μL待測組織處理樣品混合均勻，37℃

孵化60min，然后加入到洗滌后的酶標板的凹槽；37℃孵化45min后，棄去反應液，洗滌3次，拍干后每孔再加入顯色劑A1和A2各100mL避光顯色30min，反應后，用酶標儀測溶液吸光度，與標準曲線比較，得到待測試樣中磺胺嘧啶的含量。