[發明專利]一種特異性檢測單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的熒光PCR方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201710308453.4
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN106916907A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 方園;余圣良;周健
• 申請（專利權）人: 張家港藍蘇生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 汪青,賴婉婷

技術領域

本發明屬于微生物體外核酸檢測領域，具體涉及一種特異性檢測單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的熒光PCR方法及試劑盒，能夠對單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的DNA進行定性檢測，可以作為有效的檢測工具。

背景技術

單純皰疹病毒(Herpes Simplex Viruses，HSV)屬皰疹病毒科，病毒顆粒直徑約180納米，人類是單純皰疹病毒唯一的自然宿主。同時，單純皰疹病毒主要分兩型，即單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV1)和單純皰疹病毒Ⅱ型(HSV2)。HSV1主要引起生殖道以外的口腔、皮膚、粘膜或其他器官感染，而HSV2主要引起生殖道感染。

孕婦在孕程的早中晚期的首次感染對胎兒均有嚴重影響，可導致流產，發育遲緩，先天性畸形，智力障礙，視網膜脈絡膜炎等。大多數新生兒感染是因為陰道分娩受染，雖然出生時外表可正常，但產后3周內逐漸出現癥狀：一是在皮膚、口腔、眼結合膜處等出現皰疹；二是中樞神經系統異常，顱內壓增高，抽搐等；三是全身性彌散型，表現為黃疸，肝炎，肺炎等。未經及時治療的新生兒單純皰疹病毒感染，有很大概率導致死亡或有神經系統后遺癥。

目前，臨床實驗室檢測多采用血清學試驗，如ELISA、RIA和IFA等，檢測特異性抗體。血清單純皰疹病毒-IgM陽性證明近期感染己持續2～4個月。血清單純皰疹病毒-IgG陽性則提示既往感染。由于單純皰疹病毒抗原來源困難，血清學試驗尚難普及，而且某些人群感染病毒后抗體反應很弱或不產生抗體，因此僅以抗體檢測結果不能準確判定單純皰疹病毒感染情況，需輔以抗原或核酸檢測結果作為診斷和治療的依據。目前比較成熟的核酸檢測方法是用熒光PCR方法，該方法克服了常規PCR法特異性差、易污染、結果分析操作步驟多等缺點，采用TaqMan方法或稱雙標探針法(熒光淬滅探針或稱FQ探針)，即在其5’端和3’端分別標記一個熒光報告基團和一個淬滅基團。靶序列的特異性探針和特異性的PCR引物同時使用，設計的該探針在上下游PCR引物的范圍內退火，由三個寡核苷酸共同結合于目的基因片段，使其特異性大大增強。在PCR的延伸階段，Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報告基團從探針上切割下來。隨著PCR循環數的增加，游離報告基團的數量不斷的增加，實時檢測從游離熒光基團上釋放的熒光信號，從而對靶序列進行定性分析。該PCR反應在封閉系統內進行，分析結果也無需開封，因此，避免了PCR產物污染的發生。

目前，也有熒光PCR方法用于檢測單純皰疹病毒的報道，但是開發更多有效、快速、準確、靈敏度高、特異性強的熒光PCR方法用的引物和探針，并將此引物和探針用于檢測試劑盒也是本領域追求的目標。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種特異性檢測單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型核酸的熒光PCR試劑盒，該試劑盒具有靈敏、特異和高效率的特點，從而實現檢測樣本中單純皰疹病毒的核酸，實現定性的目的。

為解決以上技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種特異性檢測單純皰疹病毒Ⅰ、Ⅱ型核酸的熒光PCR試劑盒，包括單純皰疹病毒Ⅰ型特異性引物對和熒光探針、單純皰疹病毒Ⅱ型特異性引物對和熒光探針，

所述的單純皰疹病毒Ⅰ型特異性引物對和熒光探針如下：

正向引物：5’-CCCCGCTGGAACTACTATGACA-3’

反向引物：5’-TCCGTCCAGTCGTTTATCTTCA-3’

熒光探針：5’-ACGCCCCCGCGTTTGAGACC-3’；

所述的單純皰疹病毒Ⅱ型特異性引物對和熒光探針如下：

正向引物：5’-AAGCTCCCGCTAAGGACATG-3’

反向引物：5’-GGTGCTGATGATAAAGAGGATATCTAGA-3’

熒光探針：5’-AACACATCCCCCTGTTCTGGTTCCTAACG-3’。

所述的單純皰疹病毒Ⅰ型熒光探針、單純皰疹病毒Ⅱ型熒光探針的兩端分別標記報告熒光素或熒光染料、淬滅基團。標記的報告熒光素或熒光染料為FAM或其它任何可以作為探針標記的熒光素或熒光染料，例如HEX、TET、JOE、Yakima Yellow、Cy3、Cy3.5、Cy5、NED、VIC、PET、ROX、LIZ、RED、Texas Red；淬滅基團為TAMRA或其它任何可以作為淬滅基團的化學物質，例如Dabcyl、BHQ1、BHQ2。

進一步地，所述的試劑盒還包括PCR反應液、單純皰疹病毒Ⅰ型陽性質控品、單純皰疹病毒Ⅱ型陽性質控品和陰性質控品。