[發(fā)明專利]一種金磁納米顆粒的制備及其結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速檢測河豚毒素

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710307359.7
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN107271423B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 能靜;孫培龍;項(xiàng)晨;陸嘉暉;王栩俊;郟侃
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測河豚毒素方法，包括如下步驟：

(a)拉曼光譜基底制備

將Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒與NHS-PEG-NHS在pH＝7.4磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)，再與河豚毒素抗體反應(yīng)得到金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體；所述NHS-PEG-NHS的質(zhì)量用量以Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒的體積計(jì)為1mg/mL～1.5mg/mL；所述河豚毒素抗體的用量以Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒的體積計(jì)為0.1mL/mL～0.2mL/mL；

將羅丹明B拉曼染料與河豚毒素抗體在pH＝8.3的NaHCO₃緩沖液反應(yīng)得到RhB修飾后的河豚毒素抗體；所述羅丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗體的體積用量計(jì)為0.50mg/mL～0.55mg/mL；

(b)建立水中河豚毒素檢測的工作曲線

金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體與RhB修飾后的河豚毒素抗體混合后磁分離去除上清液，并轉(zhuǎn)移至凹面載玻片上，所述RhB修飾后的河豚毒素抗體與金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體的體積用量比為1:5～10；通過激光拉曼光譜儀直接照射得到空白對照的拉曼光譜圖；

取與上述步驟等量的金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體、RhB修飾后的河豚毒素抗體，與河豚毒素配制成具有梯度的0.01～0.5μg/mL濃度范圍的河豚毒素溶液，測量其拉曼光譜圖，與羅丹明RhB的拉曼光譜圖比較得河豚毒素存在時(shí)，RhB有1510cm^-1的特征峰，以1510cm^-1處的RhB特征峰的峰強(qiáng)對河豚毒素濃度進(jìn)行雙對數(shù)作圖，獲得水中快速檢測河豚毒素的工作曲線；

(c)水中河豚毒素樣品的檢測

將樣品與步驟(b)中等量的金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體、RhB修飾后的河豚毒素抗體配置成溶液，測量其拉曼光譜圖，如出現(xiàn)1510cm^-1處的RhB特征峰，讀取其峰強(qiáng)，代入步驟(b)中所得工作曲線可計(jì)算出溶液中河豚毒素的濃度，即可計(jì)算出樣品中河豚毒素的濃度；如未出現(xiàn)1510cm^-1處的RhB特征峰，說明樣品中河豚毒素的量極微少或不存在；

所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒按以下方法制備：先以Fe₃O₄納米顆粒為起始物，加入TEOS在Fe₃O₄表面形成SiO₂外殼，再加入APTES以及MPTES對SiO₂外殼表面進(jìn)行功能化，得到表面帶-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂納米顆粒；同時(shí)用檸檬酸鈉還原HAuCl₄溶液得到粒徑均勻分布的Au納米顆粒；將Au納米顆粒加入所述表面帶-NH₂和-SH的Fe₃O₄/SiO₂納米顆粒，通過-NH₂的靜電吸附和Au-S鍵的作用進(jìn)一步將Au納米顆粒致密地組裝在Fe₃O₄/SiO₂表面，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe₃O₄/SiO₂/Au金磁納米顆粒，再加入TEOS和APTES，最終得到所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒。

2.如權(quán)利要求1所述的Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆粒結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測河豚毒素方法為：

(a)稱取1mg NHS-PEG-NHS,溶于1mL pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，與1mL Fe₃O₄/SiO₂/Au/SiO₂/NH₂金磁納米顆?；旌?，振蕩反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后磁分離收集顆粒，用PBS洗滌金磁納米顆粒，再次磁分離；用2mL PBS將收集到的顆粒分散，加入0.1mL 1mg/mL河豚毒素抗體溶液，室溫下振蕩反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后保存在4℃冰箱中備用，得到金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體；

取50μg羅丹明B拉曼染料溶于0.2mL pH＝8.3的NaHCO₃緩沖液中；再加入0.1mL 1mg/mL的河豚毒素抗體；混勻后室溫下振蕩反應(yīng)6h；反應(yīng)結(jié)束后用NaHCO₃緩沖液透析混合液，除去多余的羅丹明B拉曼染料，得到RhB修飾后的河豚毒素抗體；

(b)取金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體50μl和RhB修飾后的河豚毒素抗體10μL，與河豚毒素配制成濃度為0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL時(shí)的拉曼光譜圖，以1510cm^-1處的RhB特征峰的峰強(qiáng)對河豚毒素濃度進(jìn)行雙對數(shù)作圖，獲得水中快速檢測河豚毒素的工作曲線；TTX濃度在0.5μg/mL至0.01μg/mL范圍內(nèi)，1510cm^-1處拉曼峰強(qiáng)的對數(shù)與河豚毒素濃度的對數(shù)線性關(guān)系良好，線性方程為InI₁₅₁₀＝9.34725InC_TTX+0.89229，其中l(wèi)nI₁₅₁₀為1510cm^-1處拉曼峰強(qiáng)的對數(shù)，lnC_TTX為河豚毒素濃度的對數(shù)，R＝0.9959；

(c)將樣品與金磁納米顆粒修飾后河豚毒素抗體50μL和RhB修飾后的河豚毒素抗體10μL配置成溶液，測量其拉曼光譜圖，如出現(xiàn)1510cm^-1處的RhB特征峰，讀取其峰強(qiáng)，代入步驟(b)中所得工作曲線可計(jì)算出溶液中河豚毒素的濃度，即可計(jì)算出樣品中河豚毒素的濃度；如未出現(xiàn)1510cm^-1處的RhB特征峰，說明樣品中河豚毒素的量極微少或不存在。