[發明專利]一種用于人間充質干細胞的無血清培養基及其應用

在審

• 申請號: 201710306911.0
• 申請日: 2017-05-04
• 公開（公告）號: CN106916784A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 劉力偉;劉波
• 申請（專利權）人: 劉力偉
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙)11316
• 代理人: 王惠敏

1.一種用于人間充質干細胞的無血清培養基，其特征在于，所述培養基組分包括基礎培養基、MCDB、胰島素鐵硒傳遞蛋白、人血清白蛋白、青鏈霉素以及地塞米松；所述基礎培養基為DMEM培養基。

2. 如權利要求1所述的一種用于人間充質干細胞的無血清培養基，其特征在于，所述培養基以1升計算，各組分的用量如下：

MCDB 20~100ml

胰島素鐵硒傳遞蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青鏈霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

余下為基礎培養基。

3.如權利要求1所述的一種用于人間充質干細胞的無血清培養基，其特征在于，所述培養基以1升計算，各組分的用量如下：

MCDB 50ml

胰島素鐵硒傳遞蛋白 200μl

人血清白蛋白 60μl

青鏈霉素 1ml

地塞米松 10μl

余下為基礎培養基。

4.一種將權利要求1至3任一項所述無血清培養基的應用，其特征在于，包括如下步驟：

1）人間充質干細胞原代分離培養

自人臍帶分離出人間充質干細胞后，或自骨髓血或臍帶血分離出單個核細胞后，于如下組分的培養基中進行分離純化培養：

MCDB 20~100ml

胰島素鐵硒傳遞蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青鏈霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

余下為基礎培養基；

2）擴增多次傳代培養

將步驟1）原代分離培養得到的間充質干細胞，于如下組分的擴增培養基進行擴增傳代培養：

MCDB 20~100ml

胰島素鐵硒傳遞蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青鏈霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

亞油酸 1~10ml

人源AB型血清 1~10ml

血小板衍生生長因子 10~100μl

表皮細胞生長因子 50~100μl

余下為基礎培養基。

5.如權利要求4所述無血清培養基的應用，其特征在于所述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養為自人臍帶分離人間充質干細胞，釆用貼壁法，包括如下步驟：

1）將剪碎的間距在0.2~0.5cm的臍帶小塊均勻平鋪在培養皿中；翻轉培養瓶置37℃ 4~6h；

2）4~6h后正置培養瓶，培養12h過夜；

3) 7~10天時觀察細胞爬出情況，換液1~2次將組織塊棄去，補足培養基繼續培養至可傳代。

6.如權利要求4所述無血清培養基的應用，其特征在于所述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養為自人臍帶分離人間充質干細胞，釆用酶消化法，包括如下步驟：

1）將剪碎的臍帶裝入血清瓶中，加Ⅱ型膠原酶2ml、PBS 2ml，混勻后封口，置37℃過夜，過夜期間每隔2~6混勻；

2）次日，取消化好的組織塊，取上清移置于新管；

3）加1ml0.25%胰酶，置37℃消化5min；

4）加1ml培養干細胞培養基終止消化，補PBS至10ml；

5）3000~4000 rpm離心10min；

6）棄去上清，加1ml培養干細胞培養基重懸沉淀，接種到培養皿，補足培養基培養；

7）每兩天觀察，每3天半量更換培養基，培養至可傳代。

7.如權利要求4所述無血清培養基的應用，其特征在于所述步驟1）人間充質干細胞原代分離培養為自骨髓血或臍帶血分離單個核細胞，釆用梯度離心法，包括如下步驟：

1）采集人骨髓血或健康臍帶血50ml，利用淋巴細胞分離液分離，收集單個核細胞；

2）置于培養干細胞培養基，調整細胞濃度為3×10⁶/mL，37℃、5％CO₂孵育24小時后收集貼壁細胞即得到分離純化的間充質干細胞。