[發明專利]一種利用雙信號技術的電化學DNA生物傳感器及其制備方法和應用方法

有效

• 申請號: 201710304328.6
• 申請日: 2017-05-03
• 公開（公告）號: CN107328840B
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 何漢平;李嬌;常鋼;張修華;王升富
• 申請（專利權）人: 湖北大學
• 主分類號: G01N27/416
• 分類號: G01N27/416;G01N27/327;G01N33/543
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 李小靜

1.一種利用雙信號技術的電化學DNA生物傳感器，其特征在于，該傳感器以金電極作為基底電極，二茂鐵標記的巰基化電化學分子信標探針SH-DNA-Fc通過金硫鍵修飾在基底電極上，所述SH-DNA-Fc上修飾有生物素修飾的報告DNA-目標DNA雜交復合物，所述生物素修飾的報告DNA上修飾有鏈霉親和素修飾的辣根過氧化酶；該傳感器以辣根過氧化酶和二茂鐵作為電化學雙信號，能夠特異性的檢測分析三核苷酸重復序列d(CAG)_n的序列和確定重復數目n，所述三核苷酸重復序列為目標DNA,其中所述的巰基化電化學分子信標探針SH-DNA-Fc的序列為5’-SH-(CH₂)₆-GCAGTGCATGCTCGTAGTCGCACT-Fc-3’；所述的報告DNA序列為5’-CTGCTGCTGCTGCTGTTTTTT-biotin-3’。

2.一種利用權利要求1所述電化學DNA生物傳感器的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）DNA溶液的配制：用tris-HCl緩沖液將SH-DNA-Fc配制成濃度為0.5μM的SH-DNA-Fc探針溶液，用tris-HCl緩沖液將生物素修飾的DNA即報告DNA配制成濃度為2μM的報告DNA溶液；

（2）SH-DNA-Fc探針修飾金電極的制備：將金電極浸泡在步驟（1）所述的SH-DNA-Fc探針溶液中進行探針修飾，得到修飾完的金電極；將所述修飾完的金電極進行封閉，得到所述的SH-DNA-Fc探針修飾金電極；

（3）目標DNA的捕獲：將步驟(2)所得到的SH-DNA-Fc探針修飾金電極浸泡在含有目標DNA和報告DNA的雜交溶液中，反應后，目標DNA被捕獲到金電極表面，得到dsDNA修飾的金電極；

（4）雙信號電化學DNA生物傳感器工作電極的制備：將鏈霉親和素修飾的辣根過氧化酶滴加至步驟（3）制備的dsDNA修飾的金電極表面上，雜交反應后，得到酶標記的dsDNA修飾的金電極，即雙信號電化學DNA生物傳感器工作電極；

（5）檢測底液的制備：取PB緩沖溶液、雙氧水和TMB溶液加入到檢測池中，混合均勻即得到檢測底液；

（6）雙信號電化學DNA生物傳感器進行檢測的方法：將步驟（4）得到的雙信號電化學DNA生物傳感器工作電極、飽和甘汞電極和鉑電極構成三電極體系插入步驟（5）制備的檢測底液中，進行檢測。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，tris-HCl緩沖液為三（羥甲基）氨基甲烷溶液，其濃度為0.1M,調節pH至7.4。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，在進行探針修飾時，反應溫度為20～35℃，修飾反應的時間為10～16小時。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的修飾反應時間為12小時。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，所述封閉是指使用濃度為1mM的巰基己醇進行封閉。

7.根據權利要求2-4中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，反應的溫度為37℃，反應時間為1小時。

8. 根據權利要求2-4中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（3）中，所述報告DNA溶液的濃度為1.5～3 μM。

9.根據權利要求2-4中任意一項所述的方法，其特征在于，步驟（4）中，反應溫度為20～37℃，反應時間為0.5～1小時；所述鏈霉親和素修飾的辣根過氧化酶，濃度為1～3 μM。

10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（5）中，檢測底液的制備具體包括：分別取4mL的0.1M PB緩沖溶液、10μL的雙氧水和10μL的TMB溶液加入到檢測池中，混合均勻即得到檢測底液。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的檢測方法包括電化學測定；利用循環伏安法、電化學阻抗、方波伏安法和電流-時間法進行掃描，根據電化學信號數據繪制標準曲線圖；利用酶催化信號與二茂鐵信號的比值，確定n值的大小。