[發明專利]一種監測石油降解菌群結構變化的方法

在審

• 申請號: 201710303202.7
• 申請日: 2017-05-03
• 公開（公告）號: CN108796096A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 湯瑤;王紅;吳文韜;李龍;李鐘波
• 申請（專利權）人: 奧為（天津）環保科技有限公司;天津市拉貝爾實驗室設備有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種監測石油降解菌群落結構變化的方法，屬于微生物生態技術領域。該方法利用New Probe細菌總DNA提取試劑盒對石油降解菌總DNA進行提取；對PCR擴增體系中DNA模板量、引物量和程序中退火溫度、循環數進行了優化；對變性梯度凝膠電泳（DGGE）中凝膠濃度、電泳電壓、電泳時間、APS量、TEMED量也進行了優化。本發明既克服了純培養技術的缺點，具有簡便、快速、高效、穩定等特點。該方法為監測石油降解菌群在實際降解過程中的動態變化和開發不同階段石油降解功能菌提供一種方法。

技術領域

本發明涉及一種監測石油降解菌群落結構變化的方法，屬于微生物生態技術領域。

背景技術

PCR-DGGE技術突破了傳統的人工培養基的束縛，從基因層次探究細菌群落組成變化，可直接分析復雜樣品中的混合菌群結構，更加真實地反映了自然狀態下的微生物的多樣性。該技術主要包括DNA的提取、PCR擴增、DGGE凝膠電泳三大主要步驟。DNA是PCR-DGGE技術的核心原材料，一般石油環境樣品中雜質較多，DNA的提取也會變得復雜。DNA質量是研究石油環境中微生物群落結構的保證，研究中通常采用傳統方法提取細菌DNA，但此過程中試劑配制繁瑣、用量極少，容易造成試劑浪費且操作費時；目前多采用進口試劑盒提取DNA，由于價格昂貴，難以普及使用。在PCR步驟中，PCR的隨機性較強并且受到多種因素影響，通常會產生許多非目的片段產物，比如異源雙鏈、二聚體等，這些副產物均會影響細菌群落多樣性的真實性。DNA模板量、引物量、退火溫度、循環數是影響PCR特異性擴增的主要因素。DNA的提取質量和PCR的穩定擴增是變性梯度凝膠電泳的基礎，影響其效果的主要條件包括凝膠濃度、電泳電壓、電泳時間，電泳條件不合適對圖譜的效果有直接影響。

鑒于PCR-DGGE技術在石油降解菌群落結構的研究中存在的問題，有必要針對各技術中的不足之處進行改進，從而完善技術條件，保證提取的DNA質量，穩定擴增目的片段，獲取清楚的DGGE圖譜。

發明內容

為了克服背景技術中的不足，本發明建立了一種改進的PCR-DGGE方法用于監測海洋石油污染生物修復過程中石油降解菌群落結構的變化，該方法能夠真實反映石油降解過程中菌群的動態變化，有利于開發不同階段石油降解功能菌。

本發明的技術方案包括下列步驟：

a）采用試劑盒對含石油培養液中石油降解菌總DNA進行提取；

b）以所提取DNA為模板，PCR擴增出目的片段；

c）通過變性梯度凝膠電泳分離PCR擴增片段，獲得指紋圖譜；

d）勢條帶膠回收測序；

e）序結果在美國生物信息技術中心（NCBI）數據庫中進行序列的同源性比對和分析。

上述方案步驟a）中：采用New Probe細菌總DNA提取試劑盒提取石油降解菌總DNA。

上述方案步驟b）中：對DNA模板量、引物量、退火溫度、循環數進行了優化，優化后PCR體系為25 μL 10 X Master、3 μL DNA模板、1 μL正向引物、1 μL反向引物、20 μLddH₂O；優化后擴增程序為94 ℃預變性4 min、94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，25個循環、72 ℃最終延伸6 min。

上述方案步驟b）中：對變性梯度凝膠電泳條件中凝膠濃度、電泳電壓、電泳時間進行了優化，電泳條件包括丙烯酰胺凝膠濃度為8%，凝膠變性范圍為30%-60%，凝膠溶液中加入100 μL APS和18 μL TEMED；PCR產物與加樣緩沖液以4：1混合，共20 μL；電泳溫度為60℃、電泳電壓60 v、電泳時間16 h。