[發(fā)明專利]精子頂體酶的快速提取方法及其活性的流式檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710302258.0
• 申請(qǐng)日: 2017-05-02
• 公開（公告）號(hào): CN106896016B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 房海燕;高攀;陳繼勇;薛志剛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江星博生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): G01N1/34
• 分類號(hào): G01N1/34;G01N15/14
• 代理公司: 寧波高新區(qū)核心力專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33273
• 代理人: 袁麗花

1.一種精子頂體酶的快速提取方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將含有7.5*10⁶個(gè)精子數(shù)目的精液加入到離心管中，于10000rpm離心2min，吸去離心后管內(nèi)的精漿部份，保留下層精子沉淀；

(2)在含有精子沉淀的離心管中加入200uL破膜液，使精子沉淀團(tuán)均勻懸浮后，于7000rpm離心2min后，去掉上清，然后加入400uL提取液，使精子于37℃懸浮10min，再于12000rpm離心3min后，收集上清，即獲得頂體酶提取物，其中每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，Triton-100 0.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g；每100ml提取液中含BSA 1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g，其中破膜液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量磷酸二氫鈉1.2g、疊氮鈉0.05g和0.2-0.4ml Triton-100溶于80亳升去離子水中，用1N HCl調(diào)節(jié)pH至4-6后，用去離子水定容至100毫升，用0.22微米的濾膜過(guò)濾后即得到破膜液，所述的提取液的配制方法如下：準(zhǔn)確稱量牛血清白蛋白(BSA)1g，氯化鈉0.35g，磷酸一氫鈉1.19g，二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g，溶于80亳升去離子水中，用1N氫氧化鈉調(diào)pH至7.0-8.0，然后用去離子水定容至100亳升，用0.22微米的濾膜過(guò)濾后即得到提取液。

2.一種精子頂體酶活性的流式檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)收集樣本：將新鮮采集、液化完全的精子樣本通過(guò)精子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，取7.5*10⁶個(gè)精子數(shù)目的精液，于10000rpm離心2min，用槍頭吸棄上清，留下精子樣本沉淀待用；

(2)裂解細(xì)胞：向步驟(1)中得到的精子細(xì)胞沉淀里加入200uL破膜液，用槍頭上下吹打細(xì)胞，使精子細(xì)胞充分重懸，將重懸液7000rpm離心2-4min后，用槍頭吸去上清液，留下沉淀待用，其中所述的破膜液配方為：每100ml破膜液中含磷酸二氫鈉1.2g，Triton-100 0.2-0.4ml和疊氮鈉0.05g；

(3)溶解頂體酶：向步驟(2)中的沉淀細(xì)胞團(tuán)里加入400uL提取液，用槍頭上下吸打，充分混勻沉淀，在37攝氏度金屬浴上孵育10min后，12000rpm離心2min，吸取上清液即為頂體酶提取液；其中所述的提取液配方為：每100ml提取液中含BSA 1g、氯化鈉0.35g、磷酸一氫鈉1.19g、二水磷酸二氫鈉0.25g和疊氮鈉0.05g；

(4)酶切熒光微球：吸取步驟(3)中得到的頂體酶提取液100uL，加入100uLPB緩沖溶液，再加入含有5*10⁴個(gè)頂體酶底物熒光微球的溶液，使酶切體系為250uL，24攝氏度孵育1小時(shí)后，加入終止劑終止反應(yīng)1-2min；

(5)流式檢測(cè)：將步驟(4)中酶切反應(yīng)后的混合液在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)；

(6)酶活計(jì)算：根據(jù)流式細(xì)胞儀上得到的熒光值，計(jì)算熒光衰減率，根據(jù)酶活衰減率標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.0001X²+0.0355X+67.324，計(jì)算獲得頂體酶的酶活，其中y代表頂體酶酶活性，單位為μIU，X代表熒光衰減率。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精子頂體酶活性的流式檢測(cè)方法，其特征在于步驟(4)中所述PB緩沖溶液的配方為：0.1M NaH₂PO₄，0.5M NaCl，pH值為7-8，配置好的緩沖液用0.22微米的濾膜過(guò)濾。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精子頂體酶活性的流式檢測(cè)方法，其特征在于步驟(4)中所述的終止劑是含有苯甲脒的去離子水溶液，每100ml終止液中含有17.46g苯甲脒。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精子頂體酶活性的流式檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(4)中所述的頂體酶底物熒光微球包括直徑為微米級(jí)的微球，所述的微球上偶聯(lián)有能被頂體酶酶切的多肽或蛋白質(zhì)，所述的多肽或蛋白質(zhì)標(biāo)記有熒光分子基團(tuán)，所述的熒光分子基團(tuán)在流式細(xì)胞儀上被激發(fā)光照射后發(fā)射出的熒光能夠被流式細(xì)胞儀所檢測(cè)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的精子頂體酶活性的流式檢測(cè)方法，其特征在于：所述的微球的材質(zhì)為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、二氧化硅、聚乳酸或聚乳酸羥基乙酸聚合物；所述的多肽是指含有能夠被頂體酶識(shí)別的精氨酸或賴氨酸的多肽，所述的蛋白質(zhì)是指含有能夠被頂體酶識(shí)別的精氨酸或賴氨酸的蛋白質(zhì)。