[發明專利]家蠶微孢子蟲DNA2基因及其應用

有效

• 申請號: 201710301862.1
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107245492B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 劉吉平;李峙賢;孫勛勛;楊宏宇
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/22;C12N9/14;C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

本發明公開了一種家蠶微孢子蟲DNA2基因及其應用。本發明首先克隆獲得了一種家蠶微孢子蟲DNA2基因，其全長序列如SEQ ID NO.1所示，ORF框序列如SEQ ID NO.2所示，編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。并以此為基礎提供了一組特異性檢測家蠶微孢子蟲的特異性檢測引物組，對家蠶微孢子蟲具有很好的特異性和靈敏性，在家蠶微孢子蟲的特異性檢測方面具有很好的應用前景。而且，家蠶微孢子蟲DNA2基因作為一個新發現的蛋白基因，具有潛在的功能應用，本發明DNA2基因的發現對于治療和檢測的理論驗證和生產實踐均有一定的意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一種來源于家蠶微孢子蟲的解旋酶和核酸酶DNA2基因(DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2-like)及其應用。

背景技術

家蠶微孢子蟲病是病原家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis，N.b)經食下傳染或胚卵(胎)傳染，使家蠶感染發病的一種毀滅性疫病。家蠶微孢子蟲是一類細胞內專性寄生的真核生物，之前一直屬于原蟲，近些年被劃分到真菌類。因其具有垂直傳播的特點使成為了家蠶病原微生物中最受人關注的一種，也因此成為家蠶病原微生物中唯一需要檢疫的疫病。從19世紀發現到現在，家蠶微孢子蟲病對各國的養蠶業造成巨大的損失。除此之外，其他不同的微孢子蟲也可侵害其他昆蟲如蜜蜂、蝗蟲，水產如魚，哺乳動物如兔、狗，甚至也可以感染到人類，造成人角膜炎、腦炎、腸炎等疾病。

最初人們對家蠶微粒子病的檢測主要根據顯微鏡下組織研磨液中的微孢子蟲的形態和大小進行，但是顯微鏡鏡檢的缺點是對操作人員的技術及經驗要求較高，很難區分不同種屬的微孢子蟲及其類似物。

隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測家蠶微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度。現有技術中常用的靶基因SSUrRNA，研究發現，基于16SrDNA保守區段設計的引物檢測蠶卵微孢子蟲，經常會有非目的條帶出現，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質干擾了對病原基因DNA的PCR有效擴增。發明人團隊也先后發現了多種適用于家蠶微粒子病PCR檢測的靶基因，具有較好的檢測效果，各有優勢和缺陷。

發明內容

本發明的目的是提供一種家蠶微孢子蟲DNA2基因。

本發明另一目的是提供該基因在檢測家蠶微孢子蟲方面的應用。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

本發明首先獲得了一個家蠶微孢子蟲DNA2基因，其全長序列如SEQ ID NO.1所示。其ORF框序列如SEQ ID NO.2所示。

所述家蠶微孢子蟲DNA2基因編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

同時，本發明設計了用于檢測的DNA2基因的引物，并對一些其他桑園昆蟲進行了了DNA2基因的特異性檢測，結果顯示，檢測引物F/R對家蠶微孢子蟲具有很好的特異性和靈敏性，因此，如下所述應用均應在本發明的保護范圍之內。

家蠶微孢子蟲DNA2基因在家蠶微孢子蟲特異性檢測方面的應用。

家蠶微孢子蟲DNA2基因在制備家蠶微孢子蟲特異性檢測試劑方面的應用。

一種特異性檢測家蠶微孢子蟲的檢測引物F/R，上下游引物序列分別如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。

一種實時熒光定量PCR檢測家蠶微孢子蟲的方法，包括如下步驟：以待測樣品的總DNA、中腸DNA、或蠶卵DNA為模板，以權利要求6所述的檢測引物F/R進行實時熒光定量PCR檢測；當擴增結果顯示為一條特異性388bp的條帶時，則待測樣品中含有或感染了家蠶微孢子蟲。