[發明專利]用于檢測InhibinB含量的流式檢測試劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710301829.9
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107024591A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 房海燕;高攀;陳繼勇
• 申請（專利權）人: 浙江星博生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N33/533
• 代理公司: 寧波高新區核心力專利代理事務所(普通合伙)33273
• 代理人: 袁麗花

技術領域

本發明涉及血清或精漿中Inhibin B(抑制素B)含量的檢測技術，尤其是涉及一種用于檢測Inhibin B含量的流式檢測試劑及其制備方法和應用。

背景技術

抑制素B(INH B)是轉化生長因子β超家族成員之一，屬于糖蛋白激素；由α和β_B兩個亞單位通過二硫鍵相連組成異二聚體(α-βB)，僅二聚體才有生物學活性。人們認為抑制素結合蛋白(INHBP)和Ⅲ型轉化生長因子β受體(TGFβRⅢ)是INH B受體。INH B 主要有以下功能：①通過拮抗Ⅱ型受體(typeⅡreceptors)調節活化素的生理功能。但僅在活化素反應的情況下具有活性。②調控與反映支持細胞功能，作為監測睪丸功能及評估精子發生的指標之一。③參與垂體功能的調節。從青春期開始血清INH B與卵泡刺激素(FSH)形成穩定的負反饋調控關系，而且在精曲小管功能正常情況下是主要的來自性腺的調節因素。

INHB在臨床上具有非常重要的參考作用，主要通過以下幾個方面來表現：①INH B 與精子發生障礙有重要聯系。因為INH B絕大部分來自睪丸支持細胞及各級生精細胞，因此INH B和精子發生狀態、精子計數呈正相關。認為血清中INH B是精子發生的血清標志物。精子發生功能受損時，血清INH B水平下降。此外，不育男性的間質細胞受損，功能降低，其產生INH B的β_B亞單位較少，也是血清INH B水平下降原因之一。目前認為，以抑制素B極顯著降低和FSH 3倍以上增高作為標準，可能取代睪丸活檢判斷精子發生障礙。②INH B在鑒別梗阻性與非梗阻性無精子癥方面具有重要的參考價值。INH B可作為NOA患者睪丸晚期精子細胞抽吸(TESE)的預測指標。Ron Eckardstein 等報道，以睪丸活檢形態學為金標準，發現血清INH B作為預測精子發生狀態的指數比血清FSH更具敏感性。③測定血清INH B水平可作為早期診斷POF的一項重要指標。卵巢早衰(POF)患者卵巢儲備降低，表現為卵巢內卵泡數和卵子質量均下降。由于INH B能夠比基礎FSH(bFSH)值更早、更直接反映卵巢儲備，當INH B水平不足以維持 bFSH在正常范圍時，在表現為血液bFSH的升高。因此測定血清INH B水平可作為早期診斷POF的一項重要指標。④INHB可以對IVF前卵巢反應進行判定。已有實驗表明：在月經周期第3天外源性FSH卵巢刺激實驗中發現，卵巢儲備功能正常女性INHB 水平在實驗前后24h的差值明顯高于卵巢反應差的婦女。在IVF-ET治療中發現，月經周期第3天INH B較低者，其促卵所需FSH用量大，對E2的反應性低、獲卵數少，臨床妊娠率低，周期取消率高，與第3天正常者相比，各項值有顯著差異。并且第3天INH B的下降要早于FSH的上升。⑤INH B不僅能評估卵巢儲備能力進而對輔助生殖治療的預后進行預測，而且對有效控制超促排卵用藥具有指導作用。國內已有研究發現nFSH 超排卵治療第3天時，如INH B>40pg/mL，86％的患者可完成取卵，而INH B<40pg/mL，僅70％患者完成取卵泡。

由于INH B在人類的健康領域起著重要的作用，使得科學家們和醫學工作者們不得不尋找可靠的方法來檢測人體樣本中INH B的水平，來為醫學診斷與用藥提供可靠的指導意見。臨床上檢測血清或精漿中INH B的方法有放射免疫分析(RIA)法和酶聯免疫吸附法(雙抗體夾心ELISA法)。由于RIA法不能區分INH A與INH B以及無活性的抑制素，因此實驗結果無從分析。ELISA法使用一對高度特異的抗體，僅與有功能的INH B分子特異性結合。其檢測原理是用微孔包被的βB亞單位的單克隆抗體捕獲抗原，再與檢測抗體(與酶耦聯的α亞單位的特異性單克隆抗體)結合并顯色；雖然與INH A會有0.5％的交叉反應，其特異性與敏感性基本能夠滿足科研和臨床檢測需要。

但是目前國外文獻報道的血清INH B實驗室正常參考值各家不一，集中在176.8～ 238ng/L區間，但與一些病理情況重疊，可能與受試者睪丸體積、測試樣本量、FSH的波動及肥胖等有關，這使得科學工作者們無法確定一個統一的標準來給出確定性的意見對于哪些樣本是正常的哪些樣本是超出正常值域的。還有就是，在正常成年男性血清和精漿中可檢出INH B，但不能在尿液中檢出，表明目前市面上最通用的雙抗體夾心ELISA 法的檢測靈敏度還不夠高，無法檢測一些樣本獲取度難的患者。由于目前使用的檢測方法是雙抗體夾心ELISA法，檢測過程中需要抗體抗原的孵育，洗脫，測吸光度等步驟，使得檢測步驟繁瑣費時(大于2小時)，費用昂貴以及無法多樣本高通量檢測。